漏芦对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究论文

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1、漏芦对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究论文.freell含有中药3g。兔抗TGFβ1、CTGF抗体（武汉博士德生物有限公司）；抗体稀释液（DAKO公司）；EnVision免疫组化试剂盒（广州基因有限公司）；BCA试剂盒（美国PIERCE）。1.2实验动物和分组健康雄性SD大鼠65只(由沈阳军区总医院实验动物中心提供，使用许可证：SYXK（军2002019），SPF级)，8l/kg)麻醉大鼠后，取俯卧位，固定四肢，背部手术区常规备皮、消毒、铺巾，行左背部（以肋脊角为标志）垂直切口，充分暴露左侧肾脏，分离肾周脂肪囊，迅速切除左肾上下极，立即以

2、明胶海绵压迫止血，复位肾脏，缝合各层组织。随后行右背部垂直切口，充分暴露肾脏，分离肾周脂肪囊，肾蒂手术缝线结扎后切除右侧肾脏。手术时注意分离、保留肾上腺并防止损伤。全部大鼠于术后10，行HE、PAS及Masson染色。参照Raij〔4〕等的半定量方法计算肾小球硬化指数(GlomerulosclerosisIndex，GSI)，评估肾小球硬化程度。PAS染色切片用北航医学图像管理系统进行分析。每张切片在20倍下至少取20个完整的肾小球，计算肾小球基质相对面积(肾小球基质／肾小球面积)。1.4.3肾脏免疫组织化学检测采用二步法，4μm肾组织石蜡切

3、片梯度脱腊水化后，3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）洗涤，正常兔血清封闭，依次加入TGFβ1抗体、EnVision标记Ⅱ抗，DAB显色，苏木精复染，树脂封片。肾脏CTGF检测方法同TGFβ1。有棕黄色或棕红色颗粒状物质沉积为阳性细胞。采用IMP2000图像分析系统，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。每例标本400倍镜下随机观察5个肾小球，分别计算每个肾小球TGFβ1和CTGF的阳性面积比值，即阳性面积/肾小球面积，取其平均值进行统计学分析。1.4.4蛋白印迹分析各组取

4、约100mg肾组织置于1ml裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂PMSF100μg/μl，aprotinin1μg/ml，leupeptin1μg/ml），匀浆后冰浴30min，然后4℃12000r/min离心20min。提取蛋白后用BCA法测量蛋白浓度。取等量蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移至聚氟乙烯膜上，封闭液封闭，加入1∶200稀释的TGFβ1抗体，4℃过夜。0.05％TBST洗膜3次，ECL显影。用ScionImage分析软件测定各条带灰度值，取其均值进行统计学分析。肾组织CTGF分析方法同TGFβ1。1.5统计学处理计量资

5、料采用x±s表示，数据用SPSS11.5软件包进行统计学处理。各组间均数比较采用单因素方差分析。2结果2.1尿蛋白定量变化非治疗组和治疗组大鼠尿蛋白排泄明显高于正常组(P＜0.01)；治疗组大鼠尿蛋白定量与非治疗组比较有所降低(P＜0.05)，见表1。2.2血清生化指标变化非治疗组和治疗组大鼠血肌酐明显高于正常组(P＜0.01)；治疗组大鼠血肌酐及尿素氮与非治疗组比较有所降低(P＜0.05)见表1。表1各组大鼠尿蛋白定量、血尿素氮、肌酐水平与正常组相比：1）P＜0.01，与非治疗组相比：2)P＜0.05，下表同2.3组织病理学改变和半定量分析

6、在HE染色中，非治疗组大鼠可见明显的肾小球增生、肥大，系膜增殖，局灶节段性肾小球硬化，肾小球毛细血管部分塌陷，球囊黏连，部分肾小球完全硬化，间质有炎细胞浸润，部分肾小管已萎缩、塌陷，部分肾小管内可见蛋白管型，系膜外基质显著增加，见图1。Masson、PAS染色可见明显的肾小球硬化、肾间质纤维化。治疗组与非治疗组比较，系膜增生、肾小球损伤、硬化较轻，肾间质炎细胞浸润少，肾间质面积少，间质纤维化改变轻。治疗组和非治疗组较正常组肾小球基质相对面积、GSI明显增高(P＜0.01)，但治疗组较非治疗组明显降低，两组差异有统计学意义(P＜0.05)，见表

7、2。表2各组大鼠肾小球基质/肾小球面积和GSI与正常组相比：1）P＜0.01，与非治疗组相比：2）P＜0.052.4肾组织免疫组织化学结果TGFβ1和CTGF在正常组的肾小球上皮细胞和肾小管上皮细胞有少量表达；在治疗组和非治疗组肾小球系膜细胞、上皮细胞、系膜区和肾小管上皮细胞均有表达。非治疗组大鼠TGFβ1和CTGF与正常组相比表达均明显增加（P＜0.01），治疗组与非治疗组比较TGFβ1和CTGF表达减弱（P＜0.05）。见图2，表3。2.5肾组织TGFβ1和CTGF蛋白印迹方法检测结果治疗组和非治疗组大鼠TGFβ1和CTGF与正

8、常组相比表达均明显上调（P＜0.01），治疗组TGFβ1和CTGF表达较非治疗组明显下调（P＜0.05）。见图3，表4。表3免疫组化检测各组大鼠TGFβ1和CT