漏芦对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究

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1、漏芦对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究【摘要】目的观察漏芦对慢性肾功能不全大鼠肾功能及肾组织TGFβ1和CTGF表达的影响。方法采用改良肾脏5/6切除术建立大鼠慢性肾功能不全模型，随机分为正常对照组，非治疗组和漏芦治疗组。RR组每天予以漏芦灌胃。治疗w后，检测各组大鼠的2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐及肾硬化指数，通过免疫组化及蛋白印迹观察肾组织TGFβ1和CTGF的表达。结果NT组大鼠的2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐及肾脏硬化指数较C组明显增加，而RR组大鼠2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐及肾脏硬化指数较NT组减少。NT组大鼠肾组织TGFβ1、CTGF表达较C组明显增

2、加，RR组肾组织TGFβ1、CTGF表达较NT组减弱。结论漏芦可降低慢性肾功能不全大鼠2h尿蛋白、血尿素氮、肌酐水平，减轻肾组织硬化，抑制肾组织TGFβ1和CTGF表达。漏芦对慢性肾功能不全的保护机制可能与降低肾脏TGFβ1和CTGF表达有关。【关键词】漏芦；慢性肾功能不全；肾大部分切除；转化生长因子β1；结缔组织生长因子；大鼠漏芦是多年生菊科植物，其根入药，有清热解毒、消痈、下乳及消筋通脉等功效，并有很强的抗脂质过氧化作用。近年来的研究发现漏芦具有提高细胞免疫功能、抗动脉粥样硬化、抗自由基过氧化、抗缺氧、抗炎及抗衰老等作用。全红梅等〔1〕观察其对IgA肾病小鼠有明确治

3、疗作用，且已应用于肾病综合征的临床治疗〔2〕。但其治疗慢性肾功能不全的疗效及机制鲜有报道。本研究观察漏芦对肾大部切除慢性肾功能不全大鼠尿蛋白排泄、肾功能的影响及肾组织中转化生长因子β1、结缔组织生长因子的蛋白表达及肾脏病理的变化，探讨漏芦治疗慢性肾功能不全的效果及作用机制。1材料与方法材料购买辽宁地产祁州漏芦。水提取物：漏芦根加水煎煮3次，做成水煎液，浓缩成1ml含有中药g。兔抗TGFβ1、CTGF抗体；抗体稀释液；EnVision免疫组化试剂盒；BCA试剂盒。实验动物和分组健康雄性SD大鼠65只(由沈阳军区总医院实验动物中心提供，使用许可证：SYXK，SPF级)，w龄，体

4、重g。适应性饲养1w，随机分为正常组20只和手术组45只。术后10w将手术组40只大鼠随机分为2组：非治疗组20只，治疗组20只。实验期间大鼠自由饮水、进食。肾大部切除模型建立参照文献〔3〕。腹腔注射10%水合氯醛(ml/kg)麻醉大鼠后，取俯卧位，固定四肢，背部手术区常规备皮、消毒、铺巾，行左背部垂直切口，充分暴露左侧肾脏，分离肾周脂肪囊，迅速切除左肾上下极，立即以明胶海绵压迫止血，复位肾脏，缝合各层组织。随后行右背部垂直切口，充分暴露肾脏，分离肾周脂肪囊，肾蒂手术缝线结扎后切除右侧肾脏。手术时注意分离、保留肾上腺并防止损伤。全部大鼠于术后10w以代谢笼留取2h尿液，眶内静脉

5、采血，测定2h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。检测发现手术大鼠除4只死亡，1只切口感染外全部造模成功。此后治疗组大鼠每日给予漏芦提取物(1g/kg)灌胃，同时正常组和非治疗组给予等量生理盐水灌胃。术后1w全部大鼠以代谢笼留取2h尿液，眶内静脉采血，测定2h尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐。手术组大鼠处死后取左侧残肾部分肾组织置于10％中性甲醛固定，备用于组织病理学及免疫组织化学测定；部分肾组织液氮保存用于蛋白印迹杂交检测蛋白表达。正常对照组大鼠取左侧肾脏，标本留取同手术组。检测方法尿蛋白定量及肾功能测定用考马斯亮蓝法测定尿蛋白定量。应用日立7020生化分析仪测定血尿素氮、血肌酐。病理形

6、态学观察按常规方法固定、包埋，切片厚约μm，行HE、PAS及Masson染色。参照Raij〔4〕等的半定量方法计算肾小球硬化指数(GlomerulosclerosisIndex，GSI)，评估肾小球硬化程度。PAS染色切片用北航医学图像管理系统进行分析。每张切片在20倍下至少取20个完整的肾小球，计算肾小球基质相对面积(肾小球基质／肾小球面积)。肾脏免疫组织化学检测采用二步法，μm肾组织石蜡切片梯度脱腊水化后，3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，PBS缓冲液洗涤，正常兔血清封闭，依次加入TGFβ1抗体、EnVision标记Ⅱ抗，DAB显色，苏木精复染，树脂封片。肾脏CTGF检测

7、方法同TGFβ1。有棕黄色或棕红色颗粒状物质沉积为阳性细胞。采用IMPXX图像分析系统，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。每例标本400倍镜下随机观察5个肾小球，分别计算每个肾小球TGFβ1和CTGF的阳性面积比值，即阳性面积/肾小球面积，取其平均值进行统计学分析。蛋白印迹分析各组取约100mg肾组织置于1ml裂解缓冲液，匀浆后冰浴30min，然后4℃1000r/min离心20min。提取蛋白后用BCA法测量蛋白浓度。取等量蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半