黄葵对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究

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1、黄葵对慢性肾功能不全大鼠保护机制的研究【摘要】目的观察黄葵对慢性肾功能不全大鼠肾功能及肾组织转化生长因子（TGF）β1和smad7表达的影响。方法采用腺嘌呤法建立大鼠慢性肾功能不全模型，随机分为正常组、非治疗组和治疗组，治疗组予以黄葵（2g/kg）每日1次灌胃。治疗4ad7的表达。结果非治疗组大鼠的24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐较正常组明显增加（P＜0.01），而治疗组大鼠24h尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐较非治疗组减少（P＜0.05）。非治疗组大鼠肾组织TGFβ1、smad7表达较正常组明显增加（P＜0.01），治疗组肾组织TGFβ1、s

2、mad7表达较非治疗组减弱（P＜0.05）。结论黄葵胶囊可降低慢性肾功能不全大鼠24h尿蛋白、血尿素氮、肌酐水平，抑制肾组织TGFβ1和smad7表达。黄葵胶囊对慢性肾功能不全的保护机制可能与降低肾脏TGFβ1和smad7表达有关。【关键词】黄葵；慢性肾功能不全；腺嘌呤；转化生长因子β1；smad7现代药理学研究发现，黄葵有抗血小板聚集、降血脂、清除氧自由基、提升超氧化物歧化酶(SOD)的活性及减轻免疫炎症反应〔1〕。本文拟通过观察黄葵治疗慢性肾功能不全大鼠，对尿蛋白排泄、肾功能及肾组织中转化生长因子β1（TGFβ1）、smad7蛋白表达及肾

3、脏病理变化的影响，探讨黄葵胶囊对慢性肾功能不全的疗效及作用机制。1材料与方法1.1材料黄葵胶囊（江苏苏中药业集团有限公司生产，国药准字Z19990040）。腺嘌呤(洛阳化工有限公司，产品批号2007109)。兔抗TGFβ1、Smad7抗体（武汉博士德生物有限公司）；EnVision免疫组化试剂盒（广州基因有限公司）；BCA试剂盒（美国Pierce）。1.2动物分组和模型建立雄性SD大鼠60只(由沈阳军区总医院实验动物中心提供，SPF级)，7周龄，体重190±20g。适应性饲养1g/kg灌胃，6，行HE、PAS及Masson染色，观察肾小球硬化及肾间

4、质纤维化的程度。1.3.3肾脏免疫组织化学检测采用二步法，3μm肾组织石蜡切片梯度脱腊水化后，3％过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，PBS缓冲液（0.01mol/L，pH7.4）洗涤，正常兔血清封闭，依次加入TGFβ1抗体、EnVision标记Ⅱ抗，DAB显色，苏木精复染，树脂封片。有棕黄色或棕红色颗粒状物质沉积为阳性细胞。采用IMP2000图像分析系统，对图像进行灰度变换，使阳性面积与背景分开，进行自动测量。1.3.4蛋白印迹分析为检测TGFβ1及smad7在肾脏的表达，各组取约100mg肾组织置于1ml裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂PMSF100μ

5、g/μl，aprotinin1μg/ml，leupeptin1μg/ml），匀浆后冰浴30min，然后4℃12000r/min离心20min。提取蛋白后用BCA法测量蛋白浓度。取等量蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移至聚氟乙烯膜上，封闭液封闭，加入1∶200稀释的TGFβ1抗体，4℃过夜。0.05％TBST洗膜3次，ECL显影。1.4统计学处理计量资料采用x±s表示，采用SPSS13.0软件包。各组间均数比较采用单因素方差分析，(方差齐时用LSD法、方差不齐时用Tamhane法)。2结果2.1尿蛋白定量变化非治疗组和治疗组大鼠尿蛋白排

6、泄明显高于正常组(P＜0.01)；治疗组大鼠尿蛋白定量与非治疗组比较有所降低(P＜0.05)，见表1。2.2血清生化指标变化非治疗组和治疗组大鼠血肌酐、尿素氮明显高于正常组(P＜0.01)；治疗组大鼠血肌酐、尿素氮与非治疗组比较有所降低(P＜0.05)，见表1。2.3组织病理学改变和半定量分析在HE染色中，非治疗组大鼠可见明显的肾小球增生，系膜增殖，肾小球毛细血管部分塌陷，球囊黏连，部分肾小球完全硬化，间质有炎细胞浸润，部分肾小管已萎缩，系膜外基质显著增加（图1）。Masson、PAS染色可见明显的肾小球硬化、肾间质纤维化。治疗组与非治疗组比较，肾小

7、球损伤、硬化轻，肾间质炎细胞浸润少，间质纤维化。半定量方法计算肾小球硬化指数(GSI)，评估肾小球硬化程度。治疗组和非治疗组GSI分别为60.13±12.28、88.24±14.35，较正常组GSI(2.48±1.14)明显增高(P＜0.05)，但治疗组较非治疗组明显降低，两组差异有统计学意义(P＜0.05)。2.4肾组织免疫组织化学结果非治疗组大鼠与正常组相比TGFβ1表达明显增强，而smad7表达明显减弱（P＜0.01），治疗组与非治疗组比较TGFβ1表达减弱而smad7表达增强（P＜0.05）。见表2，图2，图3。表1各组大鼠尿蛋白定量、血

8、尿素氮、肌酐水平表2免疫组化检测各组大鼠TGFβ13讨论目前研究表明，TGFβ1和其受体下游的信号转导因