小鼠促进骨髓抑制恢复相关因子il7基因的识别与克隆论文

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1、小鼠促进骨髓抑制恢复相关因子IL7基因的识别与克隆论文沈娟,胡耀华,邵红伟,肖兰凤【摘要】目的寻找促进骨髓抑制恢复的相关细胞因子，进行骨髓抑制时基因表达差异分析，并对表达上调较大的细胞因子进行克隆验证。方法尾静脉注射5Fu构建小鼠骨髓抑制模型，运用基因芯片方法分析正常小鼠与骨髓抑制模型第0，3，7，11，14天的基因表达差异.freelyelosuppression,andanalyzegeneexpressioninmyelosuppressedmiceandconfirmremarkableupregula

2、tionofgeneexpression.MethodsThemyelosuppressedmicemodeladebyinjectionof5Fuintailveils.Thegenedifferentialexpressioninday0,3,7,11and14respectivelyersofIL7arkablyightplaypositiveregulatoryrolesinsuppressionandregenerationofhematopoiesisesparedalcontrol.Conclus

3、ionsIL7ightbeclinicallyusedformyelosuppression.Keyyelosuppression癌症是当今人类生命的一大杀手，而化学治疗和放射治疗以及许多其他抗肿瘤治疗方法，都是针对快速分裂的细胞，因而主要副作用是令同样快速分裂的血细胞前体——造血干细胞受抑制，称为骨髓抑制。它可导致贫血、抗感染能力下降（免疫抑制）等不良反应，从而严重影响肿瘤的治疗效果。在骨髓移植恢复中，骨髓抑制恢复造血刺激因子在血象调节中起着至关重要的作用，恢复的正刺激因子在骨髓抑制时表达均应激升高，后随着骨髓

4、恢复降低至正常表达水平，寻找骨髓抑制恢复中的关键因子意义重大。作为白细胞介素家族成员之一，1989年白细胞介素7被发现并命名。它全长1589bp，包含6个外显子（531bp）、相应的内含子、5′和3′非翻译区；经过转录、翻译、切掉信号肽、修饰加工，形成成熟的含152个氨基酸的IL7蛋白质，是相对分子质量为25kDa的糖蛋白［1］。IL7是一种多效细胞因子,具有广泛的免疫效应，在T细胞的生长、存活及分化方面有重要作用［2］，同时有潜在趋化性质,介导单核细胞参与炎症反应。近几年发现IL7在多方面均发挥很大的潜在

5、价值，在慢性粒细胞白血病［3］、抗肿瘤［4］、抗HIV病毒感染［5］、急性冠脉综合征［6］等病理方面均有显著作用。本实验室经大规模基因表达差异分析发现，IL7基因在小鼠骨髓抑制模型中表达明显升高，可能是自体促进骨髓抑制恢复的因素之一。在正常小鼠中，IL7由于表达量较低，不易克隆。但在骨髓抑制模型小鼠的骨髓组织中克隆得到了IL7基因，验证了IL7基因上调，然后将其构建到真核高效表达质粒phCMV中，为进一步验证其在骨髓抑制恢复方面功能奠定基础。1材料与方法1.1主要材料大肠杆菌DH5α和phCMV真核表达载体

6、由本实验室保存，SPF级雄性8周龄BALB/c小鼠购自上海中科院动物所，体质量（20±1）g，MMLV反转录试剂盒购自Promega公司，Taqplus酶、Trizol、限制性内切酶EcoRI、XhoⅡ购自Fermentas公司，RNA抽提试剂盒购自Qiagen，凝胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产品，上、下游引物由Invitrogen公司合成。1.2方法1.2.1尾静脉注射5FU造成骨髓抑制模型采用尾静脉一次性注射5FU，注射量为250mg/kg（化疗的亚致死剂量），造成小鼠骨髓抑制模型，小鼠外

7、周血细胞及骨髓细胞数下降再恢复，约14d为1周期，于第0，3，7，11，14天各取6只小鼠计数外周白细胞数及骨髓细胞数。1.2.2基因芯片及芯片分析提取正常小鼠及骨髓抑制模型小鼠第0，3，7，11，14天的骨髓腔细胞交由上海晶泰生物技术有限公司制作生物基因芯片，采用小鼠cDNA芯片（Affymetrix，Codenumber：Mouse430A）和小鼠EST芯片（Affymetrix，Codenumber：Mouse430B），每块芯片上有约2万个基因或EST，与骨髓细胞抽提得RNA进行杂交，并完成基因芯片数据处理

8、工作——基因表达谱分析及功能分类分析。1.2.3引物设计根据NCBI提供的鼠IL7mRNA序列设计引物，扩增505～1145bp包含编码序列（548～1012）由上海英骏生物技术有限公司合成为sense：5′CCCTCGAGTGCAGTCCCAGTCATC3′（XhoⅡ的酶切位点）；antisense：5′CGGGATCCTCATACCTCACTGT