人胎盘组织造血干-祖细胞的分离富集论文

《人胎盘组织造血干-祖细胞的分离富集论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、人胎盘组织造血干/祖细胞的分离富集论文章涛，陈代雄，方宁，刘祖林，祁莹，刘金伟【摘要】为了探索从胎盘组织中分离富集造血干/祖细胞（HSPC）的标化流程，采用机械法加胶原酶消化法制备人胎盘组织单个细胞悬液，用羟乙基淀粉（6%HES）法从中分离出单个核细胞（MNC）.freelentofHematopoieticStem/ProgenitorCellsfromHumanPlacentaTissueAbstractTheaimofthisstudyatopoieticstem/progenitorce

2、lls(HSPC)fromhumanplacentatissue(PT).Single-cellsuspensionfromofhumanPTechanicalmethodbinedPTmunophenotypes(CD34-,CD34+CD38-,CD34+CD38+)containedinMNCmunophenotypeofeachsortingstepseter(FCM).Thecellenrichmentandrecoveryrateofeachsortingstepasingle-ce

3、llsuspensionofhumanPTbymechanicalmethodandcollagenasedigestion,nosignificantdifferenceexistedasparedbilicalcordblood(UCB)initialsample［(8.86±5.38)×108］,butthepercentageofCD34+cellsinMNCofhumanPTuchhigherthanthatinUCB［(0.44±0.29)%］(P0001).recoveryrat

4、eofMNCandCD34+cellsfromPTafterseparationentandrecoveryrateofCD34+cellsinCD34+groupatopoieticstem/progenitorcellsfromhumanplacentacanacquireHSPCentandviabilityandmaybeausefulreferenceofisolatingmethodsforfuturerelatedstudy.Keyatopoieticstemcell;placen

5、ta;MACS;umbilicalcordblood造血干/祖细胞（hematopoieticstem/progenitorcells，HSPC）存在于人骨髓、动员的外周血和脐血等组织中［1-3］。新近，有学者提出人胎盘组织中含有比脐血更为丰富的造血干细胞［4］；人胎盘组织中CD34+HSPC的百分率是脐血的8.8倍，并且人胎盘组织中免疫细胞成分较少，极有希望成为今后HSPC的新来源［5］。从人胎盘组织分离出高活性、高丰度的HSPC是对其进行相关生物学特性等研究的前提，目前尚无有关人胎盘组织HS

6、PC分离的优化方案可循。本研究旨在建立从胎盘组织中分离、纯化HSPC的标化流程，为今后人胎盘组织HSPC的深入研究打下良好的基础。材料和方法主要试剂胶原酶（collagenaseⅣ）、羟乙基淀粉（hydroxyethylstarch，HES）为Sigma公司产品。RPMI1640、新生牛血清（FCS）购自于Gibco公司。荧光标记单克隆抗体CD38-FITC、CD34-PE及CD34绝对计数试剂盒为BectonDickinson公司产品。免疫磁珠细胞分选试剂盒购自MiltenyiBiotec公司

7、。胎盘与脐血的收集收集足月分娩的人胎盘，同时采集同一胎盘的肝素抗凝脐血，HBsAg(-)，共5份。胎盘和脐血均于6小时内进入分选程序。胎盘组织单个细胞样品的制备多点剪取胎盘全层组织约80g，用Hank液反复漂洗，尽量除尽胎盘组织中的残留血液，将其剪碎，再用Hank液漂洗3次。加入0.025％胶原酶消化20分钟，用不锈钢网过滤，细胞滤液260×g离心5分钟，细胞沉淀用100mlRPMI1640悬浮混匀。人胎盘组织单个核细胞（MNC）的分离胎盘组织单个细胞悬液按4∶1的比例加入6%羟乙基淀粉（6%H

8、ES），混匀,22℃下静置45分钟至红细胞完全沉降。吸取富含单个核细胞的上层液，按1∶3的比例加入Hank液，400×g离心8分钟。弃上清，沉淀物用2ml含15%FCS的RPMI1640悬浮，再按1∶3的比例加入RBC裂解液，作用5分钟。260×g离心5分钟，细胞沉淀物用含15%FCS的RPMI1640洗涤、悬浮，经350目尼龙膜过滤。镜下计数MNC细胞，台盼蓝染色观察细胞活力（细胞活力应90%）。MNC细胞样品进行FCM分析，并作为磁式分选的起始样品。脐血按1∶1的比例加入Hank稀释后，同上