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1、脐血造血干/祖细胞研究现状及临床应用临床检验杂志1999年第5期第17港进展与讲座作者：许文荣胡嘉波顾可梁单位：镇江医学院检验系80年代以來，脐血作为造血干/祖细胞來源治疗血液病患者的有效方法受人们关注，山于临床血液疾病治疗的迫切需要，近年来较多的临床血液病和实验血液学工作者为此付出了各向艰巨的努力，在脐血的釆集、造血T/祖细胞的分离、鉴定、体外扩增及临床应用方而均取得了显著成就，本文将这些研究成果作一概要文献学习。1脐血造血干/祖细胞的含量和特性脐血中含有较丰富的更原始、能重建长期造血的十/祖细胞，具有
2、较强的口我增殖、多向分化的能力，是造血干/祖细胞乂一丰富来源。脐血中约有1%左右的有核细胞表达高水平的CD34抗原的表达。脐血CD34+细胞占有核细胞比例略低于件髓，但CD34+细胞中CD34+CD38一亚群比例明显高于骨攏。1996年Darena[l]J
3、J流式细胞仪对脐血中的CD34+细胞作双标记定量分析发现，CD34占0.84±0.83%,人部分CD34+细胞属于初始(initial)髄系分化细胞(CD34+CD33+)和运铁蛋门因子受体(CD71+)；近40%的细胞同时农达CD45RA和CD117
4、,很少细胞表达CD2、CD5、CD41(<2%)；表达淋巴细胞分化标记如CD2、CD5>CD7、CD10和CD19则小于6%。约有11%的CD34+细胞其表而缺乏HLA-DR和CD38。与竹髓和外周血相比人脐血(HUCB)CD34+细胞具有高度特界性。Kogler[2]对574份脐血的研究结果显示,平均总的有核细胞数(NC)：8.5+5X108,红系祖细胞(BFU-E)：9.5±8.6X105,粒单系祖细胞(CFU-GM)：5.7±6.3X105,粒、红、单、巨核混合祖细胞(CFU-GEMM)：1.6±1
5、.9X105o本室研究结果显示[10],CD34+细胞较文献报道要高，而造血干/祖细胞存在形态学上的不均一性。2脐血造血T/祖细胞的分离和纯化脐血造血干/祖细胞的分离和纯化是研究脐血造血干/祖细胞和临床应用的关键因素Z一，迄今有以下儿种方法川于脐血造血干/祖细胞的分离和纯化：①单纯离心分离法，该方法分离的干/祖细胞损失率达40〜80%；②不连续密度梯度离心法，脐血十7祖细胞主要集中于低密度(近1.063g/ml)组分中，该方法增加了体外操作的过程，易污染;③三联袋(triplebloodbagsystem
6、)分步离心浓集法，该法可除去59%RBC,体积减少56%,CD34+细胞回收率为87%[3]；④Ficoll、peroll.卬基纤维索、明胶、淀粉等方法，有结果表明明胶法干/祖细胞损失率较低，集落形成细胞(CFC)、CD34+细胞的冋收率分别为92%和86%；⑤免疫磁珠吸附法(MACS),生物素-抗生素亲和柱法，这些方法具有快速、纯度好、产量髙等优点，现已趋于商品化，并有应用于临床的报道；⑥流式细胞技术分选法(FCM),该方法以流式细胞仪分选CD34+及其亚群细胞纯度对高达95%〜99%,是口前分选CD3
7、4+细胞纯度最高的方法，但耗时费资，产率并不高，也难保持无菌，目前主要应用于科研。因此选择较好的脐血干/祖细胞分离纯化的方法既耍考虑纯度、产率、又要顾及牛物学活性及临床应川的可行性。3脐血造血细胞的体外扩增虽然脐血造Jfn.T7ffl细胞有极强的增殖能力，但单份脐血屮造血77祖细胞含量少，难以满足成人受者造血重建的需要，因而很大程度上限制了脐血造血干/祖细胞的临床应用。为此国内外学者做了人量的工作。1992年Broxmeyer[4]率先采川干细胞因子(SCF)联合GM-CSF,EPO,IL-3扩增脐血MN
8、C,但扩增后的细胞己不是具有增殖和分化双重能力的造血干/祖细胞，因而给临床应用带来了许多困难。1997年Piacibello等[5]从脐血中分离出CD34+细胞，采用无廿髓基质的液体培养系统，观察了多种细胞因子对脐血造血干/祖细胞的扩增情况，IL-3+FL(FET3-Ligand),IL-3+KL(c-kitligand),IL-3+FL+KL,KL+FL,IL-6+FL+KL,8周后细胞数均得到了极人的扩增，其屮IL-6+FL+KL扩增细胞近3万倍，CFU-GM增加了200倍，KL+FL扩增细胞数近1万
9、倍，CFU-GM增加了近40()倍，FL+TPO(thrombopoietin)培养脐血CD34+细胞6个月，细胞扩增了T•万倍，其中CD34+CD38一细胞扩增了3T力倍，CD34+CD38+细胞扩增了1T力倍，CFU-GM增加了1千万倍,BFU-E扩增了12.2万倍，混合造血祖细胞(CFU-M1X)扩增了4.5万倍,CFU-GEMM扩增了2.7万倍，长期培养起始细胞(LTGIC)(培养20周)扩增了8.3万倍，CFU・Bl
