罗格列酮对高糖诱导的人肾小管上皮细胞血小板反应蛋白1和bmp7表达的影响

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1、罗格列酮对高糖诱导的人肾小管上皮细胞血小板反应蛋白1和BMP7表达的影响：丁新国,李英*,李晓东,张红梅【摘要】　　目的:探讨罗格列酮(RSG)对高糖环境下人肾小管上皮细胞（HK2）血小板反应蛋白1（TSP1）和骨形成蛋白7（BMP7）mRNA和蛋白表达的影响。方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞分为正常糖对照组（NG）、高糖组（HG）、渗透浓度对照组（MG）、分别含RSG5、10、20μmol/L的高糖DMEM培养基培养的RSG干预组（R5、R10、R20）,并于培养48h后终止培养。免疫细胞化学方法检测人肾小管上皮细胞TSP1、BMP7、

2、结缔组织生长因子（CTGF）蛋白的表达,RTPCR法检测人肾小管上皮细胞中TSP1、BMP7、CTGFmRNA表达。结果:高糖环境下,HK2细胞TSP1、CTGFmRNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）,BMP7mRNA和蛋白表达明显降低（P<0.05）,加入RSG后,HK2细胞TSP1、CTGF的表达较NG组明显降低（P<0.05）,BMP7的表达明显升高（P<0.05）。结论:RSG可以抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞TSP1、CTGF高表达,提高BMP7的表达,具有一定的肾脏保护作用。【关键词】血小板

3、反应蛋白1骨形成蛋白7罗格列酮高糖肾小管上皮细胞　　近年来,发现肾小管上皮细胞在糖尿病肾病的发生发展中有着不可忽视的作用[1]。研究糖尿病小管间质病变发生、发展的机制,以及寻找干预治疗小管间质病变的措施具有重要意义。罗格列酮（rosiglitazone,RSG）属于噻唑烷二酮类药物（thiazolidinediones,TZDs）,是通过结合并激活核转录因子即过氧化物酶增殖体激活受体γ（peroxiomeproliferatoractivatedreceptorγ,PPARγ）,改善胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗而发挥作用。近年认为RSG尚有独立于增敏、

4、降血糖之外的肾脏保护作用。TZDs还具有抗炎、影响细胞增殖和转分化、抗脏器纤维化等作用。但TZDs类药物的作用是否与调节血小板反应蛋白1（thrombospondin1,TSP1）、结缔组织生长因子（connectivetissuegroorphogeicproteins7,BMP7）的表达的效应相关,目前国内外研究较少。我们利用体外实验观察RSG对高糖条件下肾小管上皮细胞表达TSP1、CTGF和BMP7表达的干预作用。　　1材料和方法　　1.1材料人肾脏近曲小管上皮细胞株（HK2）购自中国协和医科大学细胞中心。TRIzol总RNA提取试

5、剂盒（美国Invitrogen公司）,反转录（RT）试剂盒（美国Promega公司）,TaqDNA聚合酶、PCR引物及寡核苷酸片段（上海生工公司）,DMEM(美国Sigma公司）,胎牛血清（杭州四季青）。罗格列酮（天津史克必成有限公司）,小鼠抗大鼠TSP1单克隆抗体（mAb）(ACBCM公司)、山羊抗大鼠BMP7多克隆抗体（美国SantaCruz公司）、山羊抗大鼠CTGF多克隆抗体（美国SantaCruz公司）。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养及分组HK2细胞生长于含100mL/L灭活新生牛血清、100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的正

6、常糖DMEM培养基（D葡萄糖浓度5.5mmol/L）,置37℃、50mL/LCO2培养箱中培养,每3～4d更换培养液1次,待细胞生长至亚融合状态时更换为无血清DMEM培养基使细胞生长同步化24h。然后将细胞分为以下各组:①正常糖对照组（NG组含5.5mmol/LD葡萄糖）;②高糖组（HG组含25mmol/LD葡萄糖）;③渗透浓度对照组（MG组含19.5mmol/L甘露醇和5.5mmol/LD葡萄糖,终浓度为25mmol/L）,以确保实验组之间渗透浓度相同;④HG＋RSG（5μmol/L）组;⑤HG＋RSG（10μmol/L）组;⑥HG＋RSG（

7、20μmol/L）组。作用48h后取样观察,每组均含3瓶细胞（n=3）。　　1.2.2免疫细胞化学染色按实验分组条件处理后的细胞爬片,采用SABCHRPDAB法(试剂盒购自武汉博士德公司)分别检测TSP1、CTGF、BMP7的表达。一抗为山羊抗BMP7多克隆抗体(1∶100,SantaCruz公司),山羊抗CTGF多克隆抗体(1∶50,SantaCruz公司),小鼠抗TSPmAb（1∶50稀释,ABCAM公司）37℃孵育3h,滴加1∶200稀释的生物素化IgG二抗,37℃孵育1h;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液37℃孵育30min,

8、DABH2O2显色10min,苏木素复染固定。以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。显微镜下观察