正交设计优化茴香随机扩增多态dna反应体系的研究

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1、正交设计优化茴香随机扩增多态DNA反应体系的研究作者：李海渤，王羽梅，何金明【摘要】目的建立茴香的随机扩增多态DNA（RAPD）最佳反应体系。方法正交设计及方差分析应用于建立RAPD反应体系的研究。结果茴香的RAPD最佳反应体系为25μl的反应体系中，含10×Buffer2.5μl，2.0mMdNTPs3.0μl，2.0U/μlTaq酶1.0μl，2.0μmol/L随机引物4.0μl，30.0ng/μl模板DNA30ng，ddH2O13.5μl。结论正交设计及方差分析适用于茴香RAPD反应体系的建立。【关

2、键词】茴香；正交设计；随机扩增多态DNA；反应体系；方差分析　　Abstract：ObjectiveToestablishoptimalRAPDreactionsystemofFennel.MethodsTheorthogonaldesignandvarianceanalysisizetheRAPDsystem.ResultsTheoptimalFennelRAPDsystemmol/L),1.0μlTaqE(2.0U/μl),4.0μlPrimer(2.0μmol/L),1.0μlDNA(30.0ng/

3、μl),13.5μlddH2O.ConclusionTheorthogonaldesignandvarianceanalysiscanbeusedtooptimizetheRAPDsystem.　　Key;Varianceanalysis　　茴香FoeniculumvulgareMil1.为伞形科茴香属多年生宿根草本植物，原产地中海沿岸及西亚，在我国北方各地被广泛栽培。　　茴香的茎、叶、种子都含有挥发油，其主要成分为茴香醚及茴香酮，具有特殊的香味。我国北方主要把茴香作调味品或馅食。其果实可作香料及药用，有

4、温肝肾、暖胃气、散寒结的作用［1］。　　随机扩增多态DNA(RandomAmplifiedPolymorphismDNA，RAPD)标记是由g2+）2.5μl，其余组分［TaqDNA聚合酶、dNTPs（北京鼎国生物技术有限责任公司提供）；引物（北京奥科生物技术有限责任公司提供）；DNA］按表1稀释并添加，再用ddH2O将体系补至25.0μl。　　表1RAPD反应体系的正交设计及扩增结果（略）　　1.3PCR扩增与产物检测在FTH-04AB-102型PCR仪（杭州大和热磁电子有限公司）上进行扩增，热循环参数

5、为95℃预变性3min，94℃变性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。　　扩增产物在1.0％(arker，经EB染色。在hnageMasterVDS凝胶成像系统上成像检测，照相并存盘。　　1.4数据分析统计每个处理扩增后DNA片段数目，并参照Marker电泳片段的亮度对处理所得片段亮度进行打分，打分标准为：片段亮度大于等于21228bp片段，分值为5分；片段亮度介于5146～3530bp片段之间，分值为4分；片段亮度介于2027～1904bp片

6、段之间，分值为3分；片段亮度介于1584～1375bp片段之间，分值为2分；片段亮度低于1375bp片段，分值为1分。平均片段亮度＝某处理片段亮度得分总和/某处理片段总数。　　对所得片段数目及亮度两个结果分别进行方差分析及SSR法各因素水平间多重比较，获得较好的反应体系。　　1.5最佳反应体系的验证为验证最佳反应体系的稳定性，采用多个引物对多个茴香材料进行RAPD扩增，观察其重复性及稳定性。　　2结果　　2.1正交设计的处理结果及分析选用引物P41（GTTTCGCTCC）按表1设计对内蒙古茴香进行RAPD

7、扩增（见图1，表1）。分别对表1扩增片段数量及扩增片段亮度进行方差分析。结果见表～3。　　2.1.1扩增片段数量从表2可知，MSe1/MSe2＝1.26≤F0.05（8，24）＝2.36，说明实验因素之间差异不显著，即实验因素之间无交互作用。故将模型误差MSe1与试验误差MSe2合并，得MSe＝（SSe1＋SSe2）/（dfe1＋dfe2）＝1.84，进行方差分析。F检验结果表明，dNTPs（A）、随机引物（C）因素对扩增片段数量有极显著影响，而Taq酶（B）、模板DNA（D）因素对扩增片段数量影响不显著

8、，区组间差异不显著。模型误差MSe1不显著，说明试验因素间交互作用不显著，经SSR法多重比较表明，A因素第2至第5水平均与第1水平平均扩增片段数间差异极显著，第2至第5水平之间差异不显著；B因素第4水平与第1水平之间平均扩增片段数间差异显著，其余各水平间差异不显著；C因素第4，5水平结果相同，均与第1，2水平间差异极显著，与第3水平间差异不显著；D因素第1水平与其余4个水平间差异显著或极显著。综上所述，各因素的最优水平为A2至