pcdna3.1pres1gfp重组质粒构建及其小鼠精子表达

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1、pcDNA3.1preS1GFP重组质粒构建及其小鼠精子表达：李茜王培林王亮张喆郑征【摘要】目的构建绿色荧光蛋白(GFP)与乙型肝炎病毒(HBV)preS1基因的重组真核表达载体并观察其在小鼠精子内的表达。方法采用PCR方法,以HBV全基因组质粒为模板扩增HBVpreS1基因片段,利用DNA重组技术将其定向插入到含有GFP的真核表达载体pcDNA3.1GFP,经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导法转染小鼠精子,在荧光显微镜下观察并应用PCR技术检测HBVpreS1基因的存在与表达情况。结果成功构建了pcDNA3.1pre

2、S1GFP真核表达载体,将其转染小鼠精子后，在荧光显微镜下观察到转染精子头部有绿色荧光，PCR扩增得到位于HBVpreS1基因区域内长约589bp的片段。结论重组质粒pcDNA3.1preS1GFP的成功建立及其在小鼠精子内的表达，为建立新的HBVDNA垂直传递的小鼠模型奠定了实验基础。【关键词】绿色荧光蛋白质类;质粒;肝炎病毒,乙型;精子;转染;小鼠[ABSTRACT]ObjectiveToconstructpcDNA3.1preS1GFPrebinanteukaryoticexpressionvectorhar

3、boringgreenfluorescentprotein(GFP)andhepatitisBvirus(HBV)preS1geneandobservetheexpressionofsperminmice.MethodsTheHBVpreS1genefragmentplifiedfromtheHBVgenomeplasmidbyPCRandinsertedintoeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1GFP.Aftertheidentificationbydigestionandsequenc

4、ing,therebinanteukaryoticexpressionvectorofmousebyLipofectamineTM2000.ExpressionofGFPineddirectlyicroscope.TheexistenceandexpressionofHBVpreS1geneofmouseid,greenfluorescenceicroscope,,andaspecificbandat589bpthaintheareaofHBVpreS1geneidanditsexpressioninspermofmouse

5、establishesanexperimentfoundationforcreatinganeousemodelofverticaltransmissionHBVDNA.　　[KEYV启动子、多克隆位点(MCS)、氨苄抗性基因及EGF基因。　　1.1.3主要药品试剂PCR试剂、DL15000购自广东东盛生物科技有限公司;限制性内切酶EcoRⅠ与XbaⅠ均购自Fermentas公司;DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、MarkerⅡ以及质粒小提试剂盒均购自TIANGEN生化科技有限公司;脂质体LipofectamineTM200

6、0为Invitrogen公司产品;DH5α感受态细胞、T4DNAligase均购自北京全式金生物技术有限公司;所用引物由上海生工生物工程有限公司合成;DNA测序由TIANGEN生化科技有限公司承担;其他化学试剂均为国产分析纯产品，M2培养液自行配制。　　1.2方法　　1.2.1PCR技术扩增HBV基因组preS1基因片段依据GenBank中的ayr亚型HBV基因组序列，2.5转染后精子preS1基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测　　转染后精子的PCR产物经15g/L的琼脂糖凝胶电泳40min，得到一条长约589bp的条带，与

7、预期片段大小一致(图3)。　　3讨论　　真正意义上的HBV垂直传播是指病人的生殖细胞受HBV的感染,在受精时通过精子或卵子,将HBV带到胚胎使子代患病的一种传播方式[10]。20世纪70年代初，国外即有学者在乙型肝炎病人精液、阴道分泌物以及月经血内检测出HBsAg,证实精液有传染性。自从BLUMBERG首次推测HBVDNA有整合入宿主生殖细胞基因内传播至子代的可能性之后,研究发现,人和动物的生殖细胞(包括精、卵细胞)内存在HBVDNA。本实验室长期以来致力于对HBV垂直传播机制的实验研究。王培林等于国内外首次为HBV基因组在

8、父子、母子之间的垂直传播提供了组织学和细胞学的证据;高慧婕等[5]应用阳离子转染剂介导转染体外培养的小鼠精细胞，采用精子载体法建立了HBVDNA垂直传播小鼠模型;王冲通过构建HBVDNA卵细胞载体,检测HBsAg(+)乙型肝炎病人卵巢组织中HBVDNA的存在，为乙型肝炎通过卵细胞垂直传播的