人β-ngf重组质粒转染gfp转基因的小鼠骨髓基质干细胞的实验研究

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1、分类号：R764.43+6学校代码：10601密级：公开编号:Y1002122硕士学位论文人β-NGF重组质粒转染GFP转基因的小鼠骨髓基质干细胞的实验研究学科专业:外科学研究方向:老年性耳聋研究生姓名:王亮亮学号:Y1002122学位类型科学学位导师姓名:刘强和教授二O一三年四月独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或

2、证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日----------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权桂林医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编

3、学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》、《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日I目录人-β-NGF重组质粒转染GFP转基因小鼠骨髓基质干细胞的实验研究……1中文摘要………………………………………………………………1ABSTRACT……………………………………………………………2英汉缩略词对照表……………………………………

4、………………………5前言……………………………………………………………………61材料与方法………………………………………………………101.1实验材料与仪器………………………………………………………101.2实验试剂………………………………………………………………101.3实验方法………………………………………………………………112结果…………………………………………………………………172.1骨髓基质干细胞表型鉴定及形态观察…………………………………172.1.1骨髓基质干细胞表型鉴定………………………………………………17

5、2.1.2荧光显微镜下小鼠骨髓基质干细胞形态………………………………182.2重组质粒双酶切结果……………………………………………………182.3ELISA检测重组质粒NGF蛋白表达结果………………………………192.4转染后各组小鼠骨髓基质干细胞形态观察……………………………203讨论…………………………………………………………………213.1内耳基因治疗载体的选择………………………………………………213.2骨髓基质干细胞作为目的基因的载体所具有的特性…………………223.3NGF的营养作用及促进干细胞分化为神经元细胞的作用

6、…………233.4NGF目的基因在骨髓基质干细胞中的表达……………………………243.5GFP荧光蛋白特性及其标记作用………………………………………264结论…………………………………………………………………27II参考文献………………………………………………………………28综述……………………………………………………………………………34攻读学位期间发表的学术论文目录…………………………………………45致谢……………………………………………………………………………46III人-β-NGF重组质粒转染GFP转基因小鼠骨髓基质干细

7、胞的实验研究中文摘要目的：构建、并观察携带人-β-NGF（nervegrowthfactor,神经生长因子）重组质粒的骨髓基质干细胞（bonemarrowstromalstemcell,BMSC）的生物学特性，为应用β-NGF修饰的BMSC进行耳蜗移植治疗老年聋的动物实验研究提供支持。方法：将含有重组质粒的阳性克隆大肠杆菌接种至37℃预温的LB培养基中，37℃震荡培养24小时进行细菌扩增，取扩增好的菌夜按质粒提取试剂盒说明提取重组质粒，提取成功后对其进行HindIII、XhoI双酶切鉴定，-20℃保存备用。复苏小鼠骨髓基质干细胞

8、，流式细胞学鉴定其表面CD标记，然后将GFP转基因的小鼠骨髓基质干细胞分为四组：A组为脂质体2000包裹的重组质粒转染组；B组为脂质体转染组；C组为脂质体包裹的空质粒转染组；D组为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液的阴性对照组。采用脂质体Lipofecta