ngf、bdnf基因转染大鼠骨髓基质干细胞后的表达和诱导分化以及对神经胶质细胞保护作用的实验的研究

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1、四川大学临床医学博士专业学位论文NGF,BDNF基因转染大鼠骨髓基质干细胞后的表达和诱导分化以及对神经胶质细胞保护作用的实验研究中文摘要目的:研究NGF和BDNF基因分别和共转染大鼠骨髓基质干细胞(MSCs)，对其不同的诱导分化作用，以及MSCs作为种子细胞对缺氧凋亡的神经胶质细胞的保护作用，探讨MSCs和星形胶质细胞的最佳培养条件、神经营养因子对MSCs的诱导分化和转染后MSCs神经保护机制。为治疗继发性神经损害和促进损伤的神经系统功能恢复提供新思路。方法:采用密度梯度离心法分离SD大鼠的MSCs，作原代和传代培养，免疫细

2、胞化学方法鉴定SH3抗原;在前期系列微基因构建的基础上，应用DNA室构建的含人I型胶原基因调节元件(COLIAI)-NGF/BDNFcDNA微基因，碱裂解法提取pSVCEP-NGF-CAT、pSVCEP-BDNF-CAT和pSVCEP-CAT重组质粒DNA，分别经EcoRI/HindIII,SalI/HindIII和HindIII/BamHI酶切图谱分析:经LipofectAMINETM介导转染传第一代(P1)MSCs，同时转染空载体pSVCEP-CAT作为阴性对照和pEGFP-C,用以观察转染效率:G418筛选阳性细胞克隆

3、;直接法ELLSA测定MSCs培养液中2天、2周和4周的NGF和BDNF;原位杂交法检测MSCs表达的NGF和BDNF;激光免疫共聚焦显微镜观测基因转染后MSCs表达的NGF,BDNF,Nestin,NF,NSE和GFAP。原代培养和纯化新生SD大鼠的神经星形胶质细胞，免疫细胞化学鉴定GFAP;缺氧24h诱导星形胶质细胞凋亡后，用NGF和BDNF转染的MSCs与之共培养1周和2周，免疫细胞化学观察Caspase-3和Fas的表达，流式细胞仪观测凋亡和JA、死细胞的比例。四川大学临床医学博士专业学位论文结果:分离培养的MSCs

4、纯度可以达到85%以上，MSc，能表达SH3;酶切图谱分析证实，质粒DNA分别含390bpR-NGF,760bpBDNFcDNA插入片段。含pSVCEP-NGF-CAT、pSVCEP-BDNF-CAT和pSVCEP-CAT的转化宿主菌JM109，经1PTG诱导培养得到成功表达;MSCs的转染效率可以达到33.3%;G418的筛选浓度为20即g/ml;2天、2周和4周时MSCs以及培养液中都有NGF和BDNF表达，MSCs都表达Nestin,NF,NSE和GFAP，共转染组表达最强。分离培养的神经胶质细胞纯度可以达到95%以上

5、，均能表达GFAP;缺氧24h能够诱导星形胶质细胞凋亡，转染后的MSCs和星形胶质细胞共培养组Caspase-3和Fas阳性细胞较少，凋亡和坏死细胞减少，以共转染组最为显著。结论:(1)经脂质体介导的外源性目的基因NGFBDNFcDNA均能分别和共同在MSc:中成功表达;(2)基因转染后的MSCs能诱导分化为神经前体细胞或神经样细胞;(3)基因转染后的MSc、对凋亡的神经胶质细胞有保护作用;(4)NGFBDNF基因共转染MSCs后对其诱导分化有联合和协同作用。关键词:骨髓基质干细胞:NGF和BDNF基因;脂质体转染;分化;神

6、经星形胶质细胞;凋亡;共培养;神经营养。四川大学临床医学博十专业学位论文ExperimentalStudyOnExpression,InducedDifferentiationandNeuronalProtectiveEffectsToGlialCellsOfRatBoneMarrowStromalStemCellsAfterNGF,BDNFGeneTransfectionAbstractObjectives:Toresearchthedifferenteffectsoftheratbonemarrowstromalcell

7、s(MSCs)diferentiationafterNGFandBDNFgenetransfection,andtheprotectionofMSCsasseedingcellstotheapoptoticastrocytecellsinducedbyhypoxiccultivation.WealsostudiedtheoptimalconditionoftheMSCscultivationandthemechanismofneurotrophicfactorsinducingitsdifferentionandthepro

8、tectiveefectsafterthosegenestransfection.Toprovideanalternativeroadtothetreatmentandfunctionalreconvertionofthesecondarynervoussysteminjury.Metho