骨髓基质干细胞表达小鼠白介素18治疗大鼠脑胶质瘤的实验的研究

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1、博士学位论文骨髓基质干细胞表达小鼠白介素．18治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究博士研究生：许刚指导老师：徐如祥教授摘要脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，尽管外科手术水平、放疗、化疗技术不断提高，但是都没有显著改善脑胶质瘤患者的预后。胶质瘤由于具有高度增殖、浸润生长及“微随体”播散的特征，手术只能切除大部分肿瘤，并不能彻底根除残存的肿瘤细胞，所以容易复发。因此，必须寻找新的治疗策略杀伤浸润到正常脑组织中残留的肿瘤细胞。随着生物技术的发展及应用，转基因技术治疗逐渐成为新的发展方向。目前，基因治疗主要包括：自杀基因、免疫基因和破坏肿瘤血管及联合基因等几个方面。以上基因治疗

2、策略，虽然各有优缺点，但实现胶质瘤的基因治疗的关键是：(1)目的基因向靶细胞迁移，到达肿瘤浸润的大脑实质；(2)持续、高效表达目的基因并消灭残存的肿瘤细胞。而目前这些治疗策略效果不满意的主要原因之一是使用病毒载体，病毒载体普遍携带基因量不足且向靶细胞迁移的能力差，于是人们在探索新的治疗方法一基因修饰的干细胞治疗脑胶质瘤。近年研究发现，肿瘤微环境中的各种因子可以趋化并促进骨髓基质干细胞(Bonemarrowstromastemcells，BMSCs)增殖，转染外源基因的骨髓基质干细胞主要集中于肿瘤的边缘，并稳定表达目的基因。肿瘤恶性程度越高则骨髓基质干细胞的迁

3、移能力就越强，而且还可以追踪“微随体”；移植入大脑半球的骨髓基中文摘要质干细胞更容易向肿瘤组织迁移。BMSCs还通过其自身的合成与分泌各种促生长因子，与受损脑组织相互作用诱导分化出功能神经细胞，完成胶质瘤及手术造成脑损伤的自我修复与重建。其中，分泌的神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)不仅能够抑制神经元的凋亡，而且能够诱导胶质瘤细胞的分化和直接抑制胶质瘤的生长。BMSCs还分泌大量的血管源性因子，包括血管生成素．1(Angiopoietin-1，Ang．1)，ifiiAng．1可以抑制肿瘤的生长，和防止肿瘤血管渗漏，能够减轻脑胶质瘤造成

4、的水肿。除此之外，BMSCs还具有易于与宿主细胞整和、稳定持续表达外源性基因、无免疫排斥反应等特点。总之，使用骨髓基质干细胞作为胶质瘤基因治疗的载体，成为胶质瘤基因治疗的热点和新的发展方向。白介素．18(Interleukin．18，IL．18)是新近发现的一种具有多种生物学活性的多功能细胞因子，它可以诱导干扰素吖(Interferon-),，IFN-q()产生，在肿瘤的原发性、继发性免疫中起重要作用。与其他细胞因子相比，IL．18的抗肿瘤效应更强大，时间更持久，且毒副作用较低。IL．18可刺激辅助性T淋巴细胞．1(Thelpercell．1，THl)细胞分

5、泌白介素．2(Interleukin一12，IL．2)、粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子(Granlxlocytc—macropHagecolonystimutaingfactor，GM-SCF)；INF-丫促进THl细胞增殖，能使新生CD4+T极化为Thl细胞和增力llThl细胞Fas配体媒介的细胞毒性作用。IL．18还可促进Fas．Fas．1配体媒介自然杀伤(Naturalkiller,NK)细胞的细胞毒活性；又可促进穿孔素介导NK细胞对靶细胞的传统杀伤活性；而且还具有抑制肿瘤血管形成等作用。系统应用IL．18可以有效地促进原发性肿瘤及转移灶的消退，这在许多

6、肿瘤动物模型中已得到证实。本课题研究主要内容是：利用BMSCs的肿瘤趋向性特点和IL．18的抑制肿瘤生长的功能，构建携带IL．18的复制缺陷型腺病毒载体，转染BMSCs，然后移植入9L胶质瘤细胞建立的Fisher344大鼠胶质瘤模型中，观察携带IL．18的BMSCs对脑胶质瘤的治疗作用，为脑胶质瘤的基因治疗探寻新的思路和策略。本研究主要包括三部分。Ⅱ博士学位论文第一部分、重组腺病毒载体Ad．mlL．18的构建及包装目的：构建表达mlL．18的复制缺陷型腺病毒载体，并进行包装、鉴定、纯化及滴度测定为后续研究奠定基础。方法：限制性内切酶HindlII、EcoRV

7、分别消化真核表达质粒Pcr3．1uni．mlL．18和穿梭质粒pAdTrack．CMV，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化目的片段，T4连接酶连接，构建出穿梭质粒pAdTrack-mlL一18。氯化钙法制备含有骨架质粒pAdEasy．1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞；重组穿梭质粒pAdTrack．mlL．18经限制性内切酶HindlII、EcoRV和基因测序鉴定正确后：用限制性内切酶PmeI线性化处理后与上述感受态细胞在细菌中进行同源性重组，构建复制缺陷型腺病毒载pAd—mlL-18。PacI线性化处理后在人胚肾(Humanembryonickidney293，HE

8、K293)细胞中进行包装，PCR法对重组子进行鉴定、