重组pcDNA3.1hBMP7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究.doc

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1、重组pcDNA3.1hBMP7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究【摘要】构建人骨形态发生蛋白-7(humanbonemorphogeneticprotein7，hBMP7)基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)的诱导成骨能力。［方法］从人类胎盘组织中克隆出hBMP7基因，与真核表达载体pcDNA3.1连接，成功构建了重组pcDNA3.1hBMP7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3.1h

2、BMP7转染组；B空载体pcDNA3.1转染组；C未转染组。使用RTPCR、免疫组织化学等方法检测hBMP7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。［结果］RTPCR、免疫组织化学检测显示经hBMP7转染的BMSCs中有BMP7表达。经hBMP7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高;经hBMP7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异(P<0.05)。［结论］成功构建了pcDN

3、A3.1hBMP7真核表达载体;外源的hBMP7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP7的基因治疗提供了坚实的理论基础。【关键词】人骨形态发生蛋白7基因转染骨髓基质干Abstract：［Objective］ToconstructarecombinanteukaryoticexpressionplasmidcarryinghumanBMP7genewhichwastransfectedintobonemarrows

4、tromalcells(BMSCs)invitroandexpressed.［Method］ClonehumanBMP7cDNAfromaChinesewomanplacentawasrecombinantedwithplasmidpcDNA3.1,toconstructeukaryoticexpressioncarrierofrecombinautpcDNA3.1hBMP-7.TheBMSCswereisolatedfromrabbitbonemarrowandculturedinvitro.Theywere

5、dividedintothreegroups:pcDNA3.1hBMP7transducedgroup;pcDNA3.1transducedgroup;untransducedgroup.TheexpressionofhBMP7wasdetectedbyRTPCR,Immuneohistochemistry.ALP,Collogen,Osteocalcinproductionweredetected.［Result］ThepcDNA3.1hBMP7transducedBMSCsexpressedhBMP

6、7atbothmRNAandproteinlevels.ALPactivitywasdetectedinpcDNA3.1hBMP7transducedcellsfromday2today10,peakingonday8.Collogen,osteocalcinproductionwereelevatedsignificantlytoo(P<0.05).［Conclusion］EukaryoticexpressioncarrierofrecombinantpcDNA3.1BMP7wasconstruc

7、tedsuccessfully.TheresultsindicatethathBMP7isexpressedinBMSCssufficientlyandisinvolvedininducingdifferentiationofBMSCsintoosteoblast.ThemethodwouldprovidesubstantialbasementforhBMP7genetherapy.6Keywords：hBMP7;genestransfection;bonemarrowstromalcells骨形态发生蛋白

8、7(BMP7)诱导成骨的能力己得到广泛证实，在临床上用来促进骨折愈合，关节间融合和防止人工假体松动等方面有良好的应用前景。但仅靠外源性植入，BMP7在骨损伤部位存在的时间及浓度是有一定限度的，往往不能满足某些骨损伤修复的需要。作者设想利用转基因技术将人BMP7基因通过载体导入骨组织工程种子细胞(骨髓基质干细胞)，使种子细胞在骨损伤局部合成和分泌BMP