重组pcdna3.1hbmp7真核表达载体的

《重组pcdna3.1hbmp7真核表达载体的》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、重组pcDNA3.1hBMP7真核表达载体的【摘要】构建人骨形态发生蛋白-7(humanbonemorphogeicprotein7，hBMP7)基因真核表达载体，评价其转染兔骨髓基质干细胞(bonemarroalcells,BMSCs)的诱导成骨能力。［方法］从人类胎盘组织中克隆出hBMP7基因，与真核表达载体pcDNA3.1连接，成功构建了重组pcDNA3.1hBMP7真核表达载体；从兔骨髓中分离培养BMSCs，分为3组：ApcDNA3.1hBMP7转染组；B空载体pcDNA3.1转染组；C未转染组。使用RTPCR、免疫组

2、织化学等方法检测hBMP7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶，胶原，骨钙蛋白合成情况。［结果］RTPCR、免疫组织化学检测显示经hBMP7转染的BMSCs中有BMP7表达。经hBMP7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2d显著增高，到第8d达到最高;经hBMP7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高，与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异(P<0.05)。［结论］成功构建了pcDNA3.1hBMP7真核表达载体;外源的hBMP7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达，并且这种外源性hBMP

3、7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力，这为hBMP7的基因治疗提供了坚实的理论基础。【关键词】人骨形态发生蛋白7基因转染骨髓基质干Abstract：［Objective］ToconstructarebinanteukaryoticexpressionplasmidcarryinghumanBMP7genearroalcells(BMSCs)invitroandexpressed.［Method］ClonehumanBMP7cDNAfromaChineseanplacentaidpcDNA3.1,toconstructeuk

4、aryoticexpressioncarrierofrebinautpcDNA3.1hBMP-7.TheBMSCsrabbitbonemarromuneohistochemistry.ALP,Collogen,OsteocalcinproductionRNAandproteinlevels.ALPactivityday2today10,peakingonday8.Collogen,osteocalcinproductionethodentforhBMP7genetherapy.Keyarroalcells骨形态发生蛋白7(BMP7)诱导成

5、骨的能力己得到广泛证实，在临床上用来促进骨折愈合，关节间融合和防止人工假体松动等方面有良好的应用前景。但仅靠外源性植入，BMP7在骨损伤部位存在的时间及浓度是有一定限度的，往往不能满足某些骨损伤修复的需要。设想利用转基因技术将人BMP7基因通过载体导入骨组织工程种子细胞(骨髓基质干细胞)，使种子细胞在骨损伤局部合成和分泌BMP7实现其诱导成骨作用，促进骨损伤的修复。在本实验中构建了重组pcDNA3.1hBMP7真核表达载体，并且选择兔骨髓基质干细胞作为基因转染的靶细胞，对其合成表达外源性BMP7及其促进骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能

6、力进行了检测，为今后将基因转移技术用于骨组织工程打下良好的基础。1材料1.1菌株、质粒和动物感受态大肠杆菌JM109购自Takara公司；pcDNA3.1真核表达载体购自Invitrogen公司；健康雄性新西兰大耳白兔(体重2kg)由哈尔滨医科大学动物中心提供。1.2工具酶和试剂盒限制性内切酶，T4DNA连接酶等均购自Takara公司；脂质体LipofectamineTM2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；反转录试剂盒购自Promega公司；碱性磷酸酶试剂盒、羟脯氨酸检测试剂盒购自武汉博士德公司。2方法2.1重组pcDNA3.1hB

7、MP7真核表达载体的构建2.1.1人BMP7基因的克隆(RTPCR)采用TRIzol试剂一步法提取人健康新鲜胎盘组织(哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供)的总RNA，应用反转录的原理得到胎盘的cDNA。根据GeneBank中报告基因序列，设计合成扩增引物，其中BMP7基因上游引物为：5gtggtaccgatgcacgtgcgctcactg3，引入KpnⅠ酶切位点，下游引物为：5agaagatctctcggaggagctagtggcag3，引入BgⅠⅡ酶切位点；进行扩增反应(PCR扩增仪为BIORAD，美国伯乐公司。循环参数如下：9

8、4℃预变性4min，94℃45s，62℃60s，72℃1.5min，33次循环，最后72℃延伸10min)。1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。