重组质粒pet-ompu的构建、表达及其对锦鲤的免疫保护作用

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1、安徽农业大学硕士学位论文重组质粒pET--OmpU的构建、表达及其对锦鲤的免疫保护作用姓名：李世东申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李槿年；张丹俊201205摘要m㈣0舢Ⅲm枷㈣删圳mIY2149982水产动物腹水病是由拟态弧菌(聆6，面聊砌拓螂，砌z)引起的一种重要的细菌性疾病。现阶段尚无有效的疫苗用于该病的免疫预防。外膜蛋白U(OutermembraneproteinU，OmpU)是存在于多种病原弧菌中比较保守的主要外膜蛋白，且已探明该蛋白是霍乱弧菌和创伤弧菌的保护性抗原。但拟态弧菌OmpU蛋白对水产动物是否具有

2、免疫保护作用至今尚不明了。本研究利用原核表达系统成功表达了拟态弧菌安徽分离株的OmpU蛋白，并检测分析了可溶性重组OmpU蛋白的免疫原性、免疫反应性以及对实验鱼的免疫保护作用。研究结果为进一步研制拟态弧菌OmpU蛋白疫苗奠定了基础。为了制备抗拟态弧菌抗体，将04．13安徽分离株的甲醛灭活菌体(200亿个／nlL)与双相乳化佐剂充分乳化制成免疫原免疫家兔。经三次免疫后，免疫兔血清中抗菌抗体的凝集价高达l：225，完全可用于后续的Wbstemblot检测分析。为了获得高效表达的可溶性重组OmpU蛋白，首先应用SigmlP在线分析软

3、件对拟态弧菌04．13菌株锄妒U基因全序列(GenBalll(收录号：DQ846743)进行信号肽分析，发现其5’端66bp编码的22个氨基酸组成信号肽。对此，设计特异性引物，PcR扩增切除信号肽的D，印U基因(1004bp)，将PcR扩增产物定向插入pET-32a(+)载体，构建出原核表达重组质粒pET_32a．D啤7U。然后采用正交试验设计L9(34)方案，通过SDS．PAGE分析培养基种类、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度等因素对蛋白表达的影响，优化出OmpU蛋白最佳表达条件，即重组菌pET-32a．D叩U／Rosseta

4、接种LB培养液，37℃振荡培养3h，然后加入O．5mmol／LIPTG继续诱导4h，即可获得较高表达量(496mg／L)的可溶性重组OmpU蛋白。为了分析可溶性重组OmpU蛋白的免疫原性、免疫反应性以及对实验鱼的免疫保护作用，在优化条件下诱导重组菌大量表达，使用镍离子金属螯合亲和层析柱对可溶性重组OmpU蛋白进行纯化并做Westemblot分析。结果显示纯化后蛋白纯度达98％，浓度为3．2mg／mL，能与抗菌抗体发生特异性反应。以重组Ompu蛋白、标签蛋白His和灭活菌体免疫锦鲤，四免后第7天心脏采血，采用ELISA检测试剂盒

5、测定血清IgM含量，同时以浓度为3×109c甜mL的菌液(100LD50)人工感染锦鲤。结果显示，四免后实验鱼血清IgM含量分别为3．32吲n1L、2．95m∥mL和4．51叫IIlL，与阴性血清IgM含量相比(2．39叫n1L)，均有不同程度升高。ompU蛋白免疫组和灭活菌体免疫组的鱼免疫保护率分别为73％和87％，His蛋白免疫组和PBS对照组鱼全部死亡。表明重组OmpU蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，对实验鱼有一定的免疫保护作用。关键词：拟态弧菌，外膜蛋白u，可溶性表达，锦鲤，免疫保护作用AbstractThe嬲ci

6、tesdiseaseiIlaquaticanimalsisanimportantdiSeasecausedbym，．面聊加缸淞．Butthereisn’tane任．ectivevacciIle向rthepreventIonofthediSeaseatpresent．Theoutermembraneprote证U(OmpU)isrelativelyconscrvedantigenamongpathogenicv西，．如spp，锄dhasbcenproVent0beamajorprotectiVeantigenofp硒，．幻c肋跆

7、，．韶and所6，．幻’，砌∥钯淞．However，itisnotclearwhetherOmpUof阳6r国聊伽z七￡博possessinlmuneprotectivee任．ect．Inthisstudy，TheOmpUpmteillofW6，．fDm砌fc”swaseXpressedsuccess如llybyprokaryoticeXpressionsystem．Theimmunogenicity'inlmunoreactiVityandimmuneprotectivee船cttokoica叩ofthesoIublerec

8、ombinantOmpUproteinweredetected．Theresuhslaidthe硒undationforthe如nherdevelopmentoftheOnlpUproteillVaccineof所6，．勋册砌记觚Inordertopreparespecial