重组质粒pet-ompu的构建、表达与其对锦鲤的免疫保护作用

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1、目录摘要．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．⋯．⋯．．．．．．．．．⋯．．．IAbstract．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．II图表目录．⋯⋯．．．．．⋯．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．Ⅶ论文中常用中英文缩写词⋯⋯．．．．．．⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯＼／lH文献综述．．．．⋯．．．．．．⋯⋯．⋯．．．．．⋯．⋯⋯．．．．．．⋯．．．1j≥I言．．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯⋯

2、⋯．．．．．．81材料与方法⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101．1质粒和菌株⋯．⋯⋯．．．．⋯．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．101．2酶类、主要试剂和培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．3实验动物．．．．．．．．⋯．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．101．4主要试剂和溶液配制．．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．⋯．．．101．4．1琼脂糖凝胶电泳所用试剂．．．．．⋯⋯．．⋯．．．．．．⋯．．．101．4．2制备感受态细胞所用试剂．．．．．．．⋯．．．

3、⋯．．．．．．⋯．．．101．4．3培养基．．．．．．⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．1l1．4．4SDS—PAGE电泳所需溶液．⋯．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．111．4．5蛋白诱导表达所需溶液．⋯⋯．．．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．121．4．6Ni柱纯化蛋白所用试剂．⋯．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．131．4．7Westel’n—blot试验所用溶液．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．．131～丰要仪器⋯．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．

4、⋯．．⋯．．．．．．．．．．141．6兔抗拟态弧菌抗体的制备．⋯．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．⋯．．141．6．1细菌培养与浓度测定⋯．⋯．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．14『V1．6．2免疫原制备与实验兔免疫⋯．．．⋯⋯．．．⋯．．．．⋯．．．141．6．3血清抗体效价测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．7重组表达质粒pET一32a—OmpU的构建与鉴定．．⋯．．．．．⋯．．141．7．1拟态弧菌基因组DNA的提取⋯⋯．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．141．7．2OmpL／基因

5、的PCR扩增．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．151．7．3重组．表达质粒的转化与鉴定．．．．．．⋯．⋯⋯．．．．．⋯．．171．8重组蛋白的可溶性表达与纯化．⋯．．．．．．．．．．．⋯．⋯．．．．181．8～重组质粒的诱导表达与鉴定．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．．181．8．2可溶性表达条件的优化．⋯．．．．．⋯⋯．⋯．．．．．．⋯．．181．8．3重组融合蛋白的大量表达⋯．．．．．⋯⋯⋯．⋯．．⋯．．181．8．4重组融合蛋白的纯化．．．⋯．．．．．．．．．．．．

6、．⋯．．⋯．．．．．191．9重组融合蛋白对锦鲤的免疫保护作用．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．191．9．1免疫原制备．．．．⋯．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．．．．．．．⋯191．9．2实验鱼的免疫．．⋯．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．191．9。3免疫鱼血清rt：l工gM含量的测定⋯．．．．．．．．．．⋯．．．⋯．．201．9．4免疫鱼的人工感染试验．．⋯⋯⋯．．．．．．．．⋯．⋯⋯．212结果与分析．．．⋯⋯⋯．．．．．⋯⋯⋯．⋯．．．．．．．．．．⋯．．222．1兔抗

7、拟态彤双菌抗体的效价．．⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．⋯．⋯．222．2OmpU基因序列的信号肽、疏水性和不稳定指数分析⋯．．．．．222．3重组表达质粒的构建与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．4重组蛋白pET一32a—OmpU的诱导表达与鉴定．．．．．．．．．．⋯．．242．5重组融合蛋白的表达形式分析⋯⋯．⋯．．．．．⋯⋯⋯．．25V2．6可溶性表达条件的优化⋯．⋯．．．⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯262．7重组融合蛋白的纯化⋯．．．．．．．．．⋯．⋯⋯．．．．．．⋯⋯282．8锦鲤免疫血清中IgM的含

8、量．．．．．．．．⋯．．．⋯．．．．．．．．．．．292．9重组蛋白对免疫鱼的免疫保护作用⋯．．．．．．．．．．．．．．⋯．．293讨论．⋯⋯⋯．．．．⋯．．．．．．．⋯⋯⋯．．．．．．．．．．．．⋯．．．303．1信号肽对拟态弧菌OmpU基因表达的影响．⋯⋯．．．．．．⋯．．303．2拟态弧菌OmpU基因可溶性表达的条件的优化⋯⋯⋯⋯．．303．3重组融合蛋白对锦鲤的免疫保护作用．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．31结论．．⋯．．．．．．⋯⋯．．．．．