表达ibv主要结构蛋白重组dev的构建及其免疫保护性评价

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文表达IBV主要结构蛋白重组DEV的构建及其免疫保护性评价Constructionandevaluationontheimmunoprotectivityofrecombinantduckenteritisvirusexpressingthemajorstructuralproteinsofinfectiousbronchitisvirus王玉龙指导教师刘胜旺研究员（中国农科院哈尔滨150000）胡永浩教授（甘肃农业大学兰州730070）学科专业名称预防兽医学研究方向动物传染病与病原分子生物学论文答辩日期2

2、015年5月30日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席冯玉萍教授评阅人冉多良教授马忠仁教授2015年6月甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要摘要鸡传染性支气管炎（Infectiousbronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus,IBV）引起的鸡的高度接触性上呼吸道及泌尿生殖道疾病。该病在很多国家和地区流行，主要感染呼吸道和肾脏，各种年龄鸡都易感，常引起产蛋鸡产蛋量和蛋品质下降，给养禽业造成严重的经济损失。鸭肠炎病毒（Duckenteritisvirus,DEV），又称鸭瘟病毒（Duckplague

3、virus,DPV），主要引起鸭、鹅及多种雁形目禽类产生急性、热性、败血性传染病，曾在多个国家和地区发生流行，给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV是疱疹病毒科成员，其基因组中部分基因是病毒复制非必需基因，可作为非复制型疫苗载体构建表达外源基因的活载体疫苗。本研究在本研究室建立的鸭肠炎病毒重组技术平台基础上，以US10基因缺失表达EGFP的重组鸭肠炎病毒为亲本病毒，应用同源重组技术分别构建表达鸡传染性支气管炎病毒主要结构蛋白N、S和S1的3株重组鸭肠炎病毒。鉴别PCR、交叉PCR检测及测序结果表明，IBVN、S和S1基因分别正确插入鸭肠炎病毒基因组内，替换病毒US1

4、0基因。Westernblot和间接免疫荧光结果表明，IBVN、S和S1蛋白均能够在重组病毒rDEV-N、rDEV-S和rDEV-S1中检测到表达，且随病毒的复制时间增加而表达量增加。对3株重组病毒的基本生物学特性进行研究，结果表明3株重组病毒的蚀斑形态和蚀斑大小与亲本病毒rDEVUS10-EGFP和野生型病毒DEVClone-03相似。与野生型病毒DEVClone-03相比，重组病毒rDEV-N、rDEV-S和rDEV-S1的病毒滴度略有下降，与其亲本病毒rDEV-EGFP病毒滴度相近。复制动力学研究表明，3株重组病毒的复制趋势与亲本病毒和野生型病毒一致，在感

5、染细胞后72h病毒滴度达到高峰，在感染后96h病毒滴度开始下降，说明重组病毒的复制能力与病毒基因组缺失的位点有关，而与插入的外源基因无关。分别将3株重组病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代至20代，重组病毒表现出良好的遗传稳定性，外源基因随病毒复制而稳定遗传并稳定表达。将获得的3株鸡传染性支气管炎重组鸭肠炎病毒免疫1月龄SPF鸡，于免疫后21d用IBV强毒株ck/CH/LDL/091022进行攻毒，同时设对照组。分别于免疫后1w、2w、3w、4w、5w检测免疫鸡抗体水平。在免疫后1w，rDEV-N免疫组有84%鸡只抗体阳转，rDEV-S和rDEV-S1免疫组有92%鸡

6、只抗体阳转。免疫后第2w，各免疫组血清抗体有不同程度下降，rDEV-N免疫组76%抗体阳性率，rDEV-S免疫组抗体阳性率下降至52%，而rDEV-S1免疫组下降至28%。至免疫后第3w，各免疫组抗体水平均显著下降，rDEV-N免疫组40%抗体阳性率，rDEV-S免疫组抗体阳性率下降至16%，而rDEV-S1免疫组下降至8%。攻毒后各组鸡只具有不同程度发病，对照组发病率为80%，rDEV-N免疫组发病率30%，rDEV-S免疫组发病率20%，rDEV-S1免疫组发病率40%。攻毒后7d对照组鸡只开始死亡，直至攻毒后12天不再有鸡只死亡。对照组死亡率为40%，rD

7、EV-N免疫组发病率30%，rDEV-S免疫组发病率10%，rDEV-S1免疫组发病率30%。于攻毒后5d，采集各组鸡只咽拭子，应用荧光定量RT-PCR检测各组鸡只呼吸道的排毒情况。对照组在攻毒后咽拭子排毒率为90%，rDEV-N免疫组攻毒后经呼吸道排毒率为20%，rDEV-S免疫组攻毒后呼吸道排毒率30%，rDEV-S1免疫组攻毒后呼吸道排毒率40%。分别于攻毒后5、10、15、20d进行抗体水平检测，从攻毒后抗体变化水平来看，各组鸡只抗体均有不同程度升高，说明攻毒成I甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要功，且攻毒后3个免疫组鸡只抗体水平均高于对照组。结果提

8、示，重组病毒免疫后的鸡只