产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究

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1、山东农业大学硕士学位论文产气荚膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究姓名：卢田粉申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：柴同杰20120612山东农业大学硕。}：学位论文中文摘要产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌(CJostridiumperfringens)是引起各种动物肠毒血症，坏死性肠炎和人创伤性气性坏疽的主要病原菌之一。该菌分为A、B、C、D、E5型，其致病因子是菌体产生的外毒素。其中Q和e两种毒素由D型产气荚膜梭菌产生，导致动物致死性肠毒血症，从而造成巨大的经济损失。到目前为止，国内

2、外学者对D型产气荚膜梭菌产生的Q和e毒素的研究还较为少见。因此我们丌展了关于这方面的研究，在本研究中，构建能够高效表达Q毒素的重组菌株和e毒素的重组菌株；然后，分另,JSfJ备包涵体粗提物，单个免疫以及共同免疫家兔，以此检测其免疫保护性，目的在于有效防控由Q和e毒素引起的牛、羊肠毒血症。首先D型产气荚膜梭菌菌株在厌氧条件下培养复活，提取DNA模板，设计特异性引物，并对其Q和e毒素的部分基因进行PCR扩增、克隆，以常规基因重组技术，将回收的目的基因片段插入到原核表达载体pET-28a中，得到重组质粒，经酶切、

3、测序鉴定后，该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达，摸索诱导最优条件，将最佳条件下的诱导产物进行SDS-PAGE电泳，并经镍柱亲和纯化目的蛋白，PBS透析，Westernblot检测了蛋白的特异性；将纯化的Q和￡毒素蛋白200ug分别混以免疫弗氏佐剂免疫家兔A组和B组，a和e毒素蛋白各lOOug混以免疫弗氏佐剂共同免疫家兔C组，定期取血清并用ELISA方法检测抗体滴度，得到Q毒素、￡毒素、Q和e毒素三个抗体消长规律图谱。结果表明，PCR扩增出长度为780bp的产物，通过Blast比对

4、，确认为Q毒素基因；PCR扩增出长度为972bp的产物，通过Blast比对，确认为￡毒素基因，表达载体pET-28a和含有目的基因的重组T载体分别双酶切，并将酶切后的线性pET-28a回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接，成功构建了pET28a-Q重组菌株和pET28a-￡重组菌株。表达产物经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳，获得大小分别为28．9KD和36．9KD特异的表达条带，表达量可分别达到32．12％和32．83％，Westernblot结果表明表达的目的蛋白具有高度的特异性。以表达的Q毒素

5、蛋白的包涵体粗提物和￡毒素蛋白的包涵体粗提物分别作为抗原，二次免疫家兔后，抗血清间接ELISA检测结果显示：经Q毒素蛋白免疫的家兔在第4周抗体效价达到最高值为5．71092；经￡毒素产气荚膜梭菌。和e毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究蛋白免疫的家兔在第4周抗体效价达到最高值8．71092：经Q和￡毒素蛋白共同免疫的家兔在第6周抗体效价达到最大值为4．71092。本研究的结论：构建的两株重组菌株BL21(DE3)能分别高效表达a和￡毒素，而且该毒素具有较高的免疫保护性，单个的免疫家兔，效果比较好，

6、共同免疫家兔也获得了一定的效价水平。该研究为进一步研制肠出血症的双价基因工程苗提供理论依据和支持。关键词：产气荚膜梭菌；Q毒素；￡毒素；表达；免疫保护性ll山东农业大学硕士学位论文AbstractCloso‘idiumpe矿ingensisoneofthemainpathogencausingavarietyofanimalenterotoxemia，necrotizingenterocolitis，andhumantraumaticgasgangrene．Cper．痧ingensisdividedinto

7、A．B，C，D，Etype，andtheexotoxinsproducedbythebacteriaarethemaincausativeagents．1’heft．and￡toxinsgeneratedbythetypeDCpe垆。ingenscauseanimalenterotoxaemia．orevendeath，andfinallycostlivestockindustrysubstantialeconomicloss．Sofar,studiesonc【and￡toxinsofthetypeDCpe

8、rfringensareverysparse．Therefore．inthepresentstudy,wefirstlyconstructedtworecombinantstrainswhichcanefficientlyexpressaand￡toxinsrespectively；thentheexpressed0【and￡toxinproteininclusionbodieswererefinedasanti