D型产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的表达与纯化.pdf

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1、第38卷／第5期／河北师范大学学报／自然科学版／V01．38N0．52O14年9月JOURNALOFHEBEINORMALUNIVERSITY／NaturalScienceEdition／Sep．2014文章编号：1000-5854(2014)05-0506—06D型产气荚膜梭菌e毒素重组蛋白的表达与纯化孙金良，王琳，刘磊，袁防，张聪敏，赵宝华(1．河北圣雪大成制药有限责任公司，河北石家庄051430；2．河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050024)摘要：复苏实验室保存的产气荚膜梭菌￡一pET28a(DE3)菌株，经限制性内切酶Eco

2、RI，XhoI双酶切鉴定后，诱导表达得到大量可溶性的￡重组毒素蛋白．对重组蛋白进行镍柱纯化，得到纯度高于95的毒素蛋白，利用WesternBlot和ElISA分析检测纯化后的毒素蛋白，显示该蛋白具有良好的特异性和免疫原性，为进一步研究单链抗体做铺垫．关键词：e毒素蛋白；表达与纯化；特异性和免疫原性中图分类号：Q78文献标志码：ADOI：10．11826／j．issn．1000—5854．2014．05．014ExpressionandPurificationoftheRecombinantClostridiumperfringensType

3、De-ToxinSUNJinliang，WANGLin。，LIULei，YUANFang，ZHANGCongmin，ZHAOBaohua(1．HebeiSaintDachengPharmaceuticalLimitedLiabilityCompany，HebeiShijiazhuang051430，China；2．CollegeofLifeScience，HebeiNormalUniversity，HebeiShijiazhuang050024，China)Abstract：ThestrainClostridiumperfringens￡一

4、pET28a(DE3)preservedinourlabwasresuscitated，andtheplasmidwasconfirmedbydoubledigestionwiththerestrictionendonucleasesEcoRIandXhoI．Then，solublerecombinantEtoxinproteinwasexpressedafterinductionandwaspurifiedbynickelcolumntoapurityofover95％．WesternBlotandELISAwereusedtoanaly

5、zethepurifiedtoxinprotein．Thepro—teinshowedgoodspecificityandimmunogenicity．Theexperimenthaslayedafoundationforfurtherresearchofthecorrespondingsingle—chainantibodyfragment，ScFv．Keywords：￡一toxin；expressionandpurification；specificityandimmunogenicity产气荚膜梭菌是一种厌氧型革兰氏阳性杆状产芽孢杆菌

6、，普遍存在于自然界及人类和动物的肠道中，能引起家畜和鸟类食物中毒及出血性肠炎、羊肠道痢疾、肠毒血症、气性坏疽等疾病口。]．根据产气荚膜梭菌产生外毒素a，，￡，c种类的不同，将其分成A，B，C，D，E5个类型．D型产气荚膜梭菌可引起牛、羊等家畜的肠毒血症等[4]，长期以来对畜牧业的发展造成很大的损失．e毒素是D型产气荚膜梭菌最主要的毒素，毒力强，给小鼠静脉注射纳克级的e毒素，短时间内即可引起小鼠死亡，其毒力仅次于肉毒毒素和破伤风毒素]．该毒素可通过气溶胶形式传播，也可通过细菌芽孢随动物的食物传播，进入家畜体内后，在肠道内大量繁殖，造成肠道菌群

7、紊乱，释放的￡毒素被肠粘膜吸收，并随着血液循环到各个器官，导致动物个体血压升高，体腔积水，局部器官出现水肿．e毒素还可以通过血脑屏障，在脑组织细胞中积累，作用于突触体膜组分等部位，损伤脑血管内皮细胞，导致神经系统紊乱，以致死亡[6-7]．每年在春夏交接之际，因D型产气荚膜梭菌e毒素中收稿日期：2014—05—28；修回日期：2014-07—12基金项目：河北省自然科学基金(2009000290)作者简介：孙金良(1972一)，男，河北栾城人，高级工程师，研究方向为微生物产品与发酵工艺．通信作者：赵宝华(1967一)，男，教授，博士生导师，研

8、究方向为微生物药物学．E—mail：zhaobaohua86178@sohu．corn·507·毒的家畜死亡率会大幅度上升．本文中，笔者利用重组的产气荚膜梭菌e毒素基因诱导表达了