rip3基因重组质粒构建及其表达对mcf7细胞死亡方式的影响

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1、天津医药2014年2月第42卷第2期109RIP3基因重组质粒构建及其表达对MCF7细胞死亡方式的影响路灿徐惠君贾勇圣佟仲生【摘要】目的建立稳定过表达RIP3基因的乳腺癌细胞株，并证实融合蛋白在细胞内的表达、定位及对MCF7细胞死亡方式的影响。方法逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测4种乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞中RIP3mRNA的表达。以正常乳腺上皮细胞MCF10AcDNA为模板，PCR扩增RIP3基因cDNA全长，将合成的RIP3编码区序列，克隆人mCherry载体的N末端，构建重组质粒mCherry—RIP3，对重组质粒进行酶切

2、鉴定及DNA~IJ序。钙法转染293T细胞，收集病毒感染MCF7细胞，杀稻瘟菌素(4mg／L)维持筛选，构建稳定表达细胞株。Westernblot、荧光显微镜等检测目的基因表达效率及蛋白定位。显微镜下观察肿瘤坏死因子(TNF)一及Caspase抑制剂z—VAD—FMK处理下mCherry-RIP3-MCF7细胞的死亡形态及比例。结果RIP3mRNA在乳腺癌细胞中普遍低表达。RIP3基因成功克隆人载体。过表达mCherry—RIP3基因的MCF7细胞可见红色荧光蛋白表达，定位于胞质。目的基因RIP3在转染细胞中为过表达。mCherry—RI

3、P3转染后增强MCF7细胞对TNF一仪联合Z—VAD—FMK诱导的细胞坏死的敏感性。结论成功构建RIP3基因过表达重组质粒，获得外源性RIP3稳定过表达的乳腺癌MCF7细胞株，mCherry—RIP3定位于胞质，并在TNF一0【介导的程序性坏死中起作用。【关键词】蛋白质类；蛋白质构象；乳腺肿瘤；质粒；坏死；细胞凋亡；肿瘤坏死因子；存活率【中图分类号】R73—3【文献标识码】A【DOI】10．39690．issn．0253—9896．2014．02．004C：onstructionofRecombinantPlasmidofHumanRlP

4、3GeneandItsEfectsontheDeathofBreastCancerMCF7CellsLUCan，XUHuijun，JIAYongsheng，TONGZhongshengDepartmentofBreastOncology,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital，NationalClinicalResearchCenterofCancer,KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy；KeyLaboratoryofBreast

5、CancerPreventionandTherapy,TianfinMedicalUniversity,MinistryofEducation,，Tianfin300060,China【Abstract】ObjectiveToconstructtherecombinantRIP3over—expressedplasmidsandtransfecttheminbreastcancerMCF7cells，andidentifytheexpressionandlocalizationoffusionprotein，aswellasitseffe

6、ctonthedeathwayofMCF7cells．MethodsTheexpressionlevelsofRIP3mRNAinfourbreastcancercelllinesandnormalmammaryepithelialcellsweredetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT—PCR)．TheRIP3codingsequencewasamplifiedbypolymerasechainreactionandsubclonedintomCherryvect

7、ortoconstructrecombinantplasmids．TheplasmidsweretransfectedintoMCF7cellsbylentivirusafterDNAsequencing，thenscreenedbybasticidin(4mg／L)for1week．TheefficienciesofRIP3expressionwerevalidatedbyWesternblottingassay．ThedeathwayofmCherry—RIP3一MCF7cellswasobservedunderthetreatmen

8、tofTNF一仅andZ—VAD—FMK．ResultsThelowestexpressionofRIP3mRNAwasfoundinMCF7cells．Thesequencingresult