cvb3 vp1基因真核质粒的构建、表达及对细胞的影响

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1、南昌大学硕士学位论文CVB3VP1基因真核质粒的构建、表达及对细胞的影响姓名：刘昕申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：黄孝天201206摘要目的：构建柯萨奇病毒(CVB3)结构蛋白VPl基因的真核质粒pBudCE4．1．VPI，并检测其在HeLa细胞中的表达，研究VPl蛋白对HeLa细胞形态、活性及细胞周期等方面的影响，为探讨CVB3的分子致病机制奠定基础。方法：1．质粒pBudCE4．1-VPl构建：抽提CVB3感染的HeLa细胞的总mRNA，RT-PCR扩增VPl基因，经KpnI和BglII双酶切后，克隆于真核载体pBudCE4．1中，酶切鉴定后进行DNA测

2、序验证；2．质粒pBudCE4．1．VPl表达：将质粒pBudCE4．1．VPl转染HeLa细胞，采用Westernblotting和间接免疫荧光技术检测VPl蛋白在HeLa细胞中的表达；3．质粒pBudCE4．1．VPl对细胞形态和活性的影响：质粒转染HeLa细胞后，倒置显微镜连续观察VPl蛋白对细胞形态的影响，通过MTT法检测HeLa细胞的活性变化；4．质粒pBudCE4．1．VPl对高尔基体的影响：采用免疫荧光双标技术分析质粒VPl蛋白对细胞高尔基体基质蛋白GMl30结构的影响；5．质粒pBudCE4．1-VPl对细胞周期的影响：以G1／S期为切入点，应用流式细胞

3、仪检测VPl转染后16h、20h、24h、28h、32h等时间点细胞周期的变化。结果：1．限制性内切酶酶切和测序结果表明VPl已成功插入pBudCE4．1载体的多克隆位点，其基因序列与CVB3m株(GI：323432)VPl基因序列完全一致。2．Westernblotting和免疫荧光技术结果显示：质粒pBudCE4．1．VPl转染HeLa细胞后能检测到VPl蛋白的表达，且表达量随转染时间的延长而增加；3．质粒pBudCE4．1．VPl转染HeLa细胞后12h，部分细胞开始变圆；随着转染时间的延长，细胞出现较为明显的病变效应，到转染48h、60h后，几乎未见正常细胞。M

4、TT法结果显示：质粒VPl转染的细胞与对照组细胞相比，ODII摘要值明显降低(尸<0．05)，且转染时间越长，细胞活性越差；4．免疫荧光技术分析结果显示：质粒pBudCE4．1-VPl转染HeLa细胞后，随VPl蛋白表达量的增加，细胞蛋白GMl30绿色荧光由带状分布趋于弥散，呈散在分布，且荧光强度减弱：5．细胞周期结果显示：质粒pBudCE4．1-VPl转染HeLa细胞16h、20h、24h、28h、32h后，与空质粒转染对照组G1期细胞相比，VPl转染组G1期细胞分别升高到：58．81％(P

5、．46％(尸<0．05)，56．96％(尸<0．05)。结论：1．成功构建CVB3VPl基因真核表达质粒pBudCE4．1．VPl，并能在HeLa细胞中表达；2．VPl蛋白作用于HeLa细胞后可引起明显的细胞病变效应；3．VPl蛋白可引起高尔基带断裂，VPl蛋白可能是参与CVB3感染引起高尔基带断裂的主要病毒蛋白之一；4．VPl蛋白进入细胞后可诱导细胞周期阻滞在G1期。关键词：柯萨奇病毒；VPl；真核载体；高尔基体；细胞周期国家自然科学基金资助项目(No．81160196)国家自然科学基金资助项目(No．3066001O)江西省教育厅科技计划项目『2006](323)江

6、西省自然科学基金(0540043)江西省科技厅科技支撑计划2008年项目江西省自然科学基金(GQY0136)IIIAbstractobjective：ABSTRACTToconstructandidentifytherecombinanteukaryoticplasmidofCoxsackievirusB3VP1gene，andtodetectitsexpressioninHeLacells．Thenobserveitseffectsoncellmorphous，cellviabilityandcellcyclewiththeaimtoinvestigatethemol

7、ecularmechanismofCVB3infection．Methods：1．ConstructionoftheplasmidpBudCE4．1-VP1：TheVP1genewasamplifiedbyPCRfromatemplateoftotalmRNAofCVB3．TheamplifiedDNAwasdirectionallyinsertedintovectorpBudCE4．1．Thentherecombinantplasmidwasidentifiedbyrestrictionendonucleasesdigestionand