dhvⅰvp1基因在昆虫细胞中的表达与真核质粒pcdnavp1构建

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1、摘要I型鸭病毒性肝炎(duckviralhepatitis，DVH．I)是由I型鸭肝炎病毒(duckhepatitisvirus，DHV-I)引起的雏鸭一种高度致死性和传播性传染病，以肝炎为其主要特征。DHV-I结构蛋白由VPl、VP3、VP0构成，其中VPl蛋白大部分暴露于病毒粒子表面，含有T细胞和B细胞抗原表位。本研究运用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了DHV-I结构蛋白VPl。根据DHV-I基因组序列设计并合成一对特异性引物，通过RT-PCR方法扩增DHV-I(A66株)VPl基因。用限制性内切酶EcoRI／HindIII消化VPl基因和转移载体pFastbacI，在T4DNA连接

2、酶作用下将二者连接构建转移质粒pFastbac-VPl。经PCR、双酶切及测序鉴定后将其转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DHlobac中，蓝白斑筛选获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid．VPl，在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9，获得重组杆状病毒rvBac．VPl。SDS．PAGE分析表明，VPl基因在昆虫细胞中获得表达，表达产物分子量约为27KDa。Western—blot检测表明，表达产物能与‘DHV-I阳性血清发生反应，具有良好的免疫反应原性。本研究成功的构建了真核表达质粒pcDNA．VPl。参照DHV-I(A66株)全基因组序列设计一对特异性引物，运用RT-PCR方法扩增V

3、Pl基因。在限制性内切酶HindIII／EcoRI作用下，分别双酶切纯化的VPl基因和真核表达载体pcDNA3．1(+)，经T4DNA连接酶连接后转化DH5aE．coil感受态细胞，提取质粒经PCR、双酶切鉴定为阳性后进行序列测定。鉴定的重组质粒命名为pcDNA．VPl，大量提取质粒并进行纯化。纯化的质粒免疫小鼠，1001xg／只，共免疫三次。采用间接ELISA方法检测免疫小鼠血清中特异性抗体水平，结果显示小鼠免疫后2l天抗体水平上升，第5周后达到高峰，并维持在此水平。而对照组与空质粒免疫组未检测到特异性抗体，表明构建的真核质粒能诱导小鼠产生体液免疫。关键词：I型鸭肝炎病毒；VPl基因；昆

4、虫细胞；表达；pcDNA．VPIAbstractDuckhepatitisvirustypeI(DHV．I)isthecausativeagentofduckviralhepatitistypeI(DVH—I)，whichischaracterizaedwithhepatitisandcausedafatalandrapidlyspreadinginyoungducklings．ThestructuralproteinofDHV-IconsistofVP1，VP3andVPO．ThestructuralproteinofVP1isexposedtothesurfaceoftheviralp

5、article，whichdeterminedthemainepitope．Inthispaper,theVP1geneofDHV—1wasexpressedininsectcellsbasedonthebaculovirusexpressionsystem．Designedandsynthesizedapairofprimersaccordingtoduckhepatitisvirustype1genomesequenceloginedintheGeneBank．VP1geneofDHV-IofA66strainwasamplifiedbyRT-PCR．Digestedthepurifi

6、edVP1geneandthevectorofpcDNA3．1(+)withtherestrictionendonucleaseofEcoRI／HindlII，thenligatedthemintheproperconditionusingtheT4DNAligase．Thedonor"plasmidpFastbac—VP1wasconfirmedbythemethodsofPCR，restrictionendonucleasedigestionandsequencinganalysis．ThepurifiedpFastbacl．VPlwastransformedintocompetent

7、cellsofDHl0BaccontaningtheshuttlevectorBacmid．Thewhiteclonieswereselectedthroughtheblue-whitescreening．rBacmid—VP1WastransfectedintotheSf9cellsusinglipofectamine2000．ThervBac．VP1Canbeaquiredwhenthecytopathiceffec