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时间:2017-12-08
《rip3基因重组质粒构建及其表达对mcf7细胞死亡方式的影响》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、天津医药2014年2月第42卷第2期109RIP3基因重组质粒构建及其表达对MCF7细胞死亡方式的影响路灿徐惠君贾勇圣佟仲生【摘要】目的建立稳定过表达RIP3基因的乳腺癌细胞株,并证实融合蛋白在细胞内的表达、定位及对MCF7细胞死亡方式的影响。方法逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测4种乳腺癌细胞及正常乳腺上皮细胞中RIP3mRNA的表达。以正常乳腺上皮细胞MCF10AcDNA为模板,PCR扩增RIP3基因cDNA全长,将合成的RIP3编码区序列,克隆人mCherry载体的N末端,构建重组质粒mCherry—RIP3,对重组质粒进行酶切
2、鉴定及DNA~IJ序。钙法转染293T细胞,收集病毒感染MCF7细胞,杀稻瘟菌素(4mg/L)维持筛选,构建稳定表达细胞株。Westernblot、荧光显微镜等检测目的基因表达效率及蛋白定位。显微镜下观察肿瘤坏死因子(TNF)一及Caspase抑制剂z—VAD—FMK处理下mCherry-RIP3-MCF7细胞的死亡形态及比例。结果RIP3mRNA在乳腺癌细胞中普遍低表达。RIP3基因成功克隆人载体。过表达mCherry—RIP3基因的MCF7细胞可见红色荧光蛋白表达,定位于胞质。目的基因RIP3在转染细胞中为过表达。mCherry—RI
3、P3转染后增强MCF7细胞对TNF一仪联合Z—VAD—FMK诱导的细胞坏死的敏感性。结论成功构建RIP3基因过表达重组质粒,获得外源性RIP3稳定过表达的乳腺癌MCF7细胞株,mCherry—RIP3定位于胞质,并在TNF一0【介导的程序性坏死中起作用。【关键词】蛋白质类;蛋白质构象;乳腺肿瘤;质粒;坏死;细胞凋亡;肿瘤坏死因子;存活率【中图分类号】R73—3【文献标识码】A【DOI】10.39690.issn.0253—9896.2014.02.004C:onstructionofRecombinantPlasmidofHumanRlP
4、3GeneandItsEfectsontheDeathofBreastCancerMCF7CellsLUCan,XUHuijun,JIAYongsheng,TONGZhongshengDepartmentofBreastOncology,TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterofCancer,KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy;KeyLaboratoryofBreast
5、CancerPreventionandTherapy,TianfinMedicalUniversity,MinistryofEducation,,Tianfin300060,China【Abstract】ObjectiveToconstructtherecombinantRIP3over—expressedplasmidsandtransfecttheminbreastcancerMCF7cells,andidentifytheexpressionandlocalizationoffusionprotein,aswellasitseffe
6、ctonthedeathwayofMCF7cells.MethodsTheexpressionlevelsofRIP3mRNAinfourbreastcancercelllinesandnormalmammaryepithelialcellsweredetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT—PCR).TheRIP3codingsequencewasamplifiedbypolymerasechainreactionandsubclonedintomCherryvect
7、ortoconstructrecombinantplasmids.TheplasmidsweretransfectedintoMCF7cellsbylentivirusafterDNAsequencing,thenscreenedbybasticidin(4mg/L)for1week.TheefficienciesofRIP3expressionwerevalidatedbyWesternblottingassay.ThedeathwayofmCherry—RIP3一MCF7cellswasobservedunderthetreatmen
8、tofTNF一仅andZ—VAD—FMK.ResultsThelowestexpressionofRIP3mRNAwasfoundinMCF7cells.Thesequencingresult
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