B71与新型隐球菌DHA1基因重组质粒的构建及其免疫保护研究

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1、中山大学硕士学位论文B7-1与新型隐球菌DHA1基因重组质粒的构建及其免疫保护研究姓名：沈纪川申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：谢奇峰2003.5.8申山大学硕士学位论良中文摘要B7．1与新型隐球菌DttAl基因重组质粒的构建及其免疫保护研究专业：内科学硕士生：沈纪川导师：谢奇峰教授摘要f新型豫球菌是一种重螫的条件致病性酵母样真菌，在免疫正常或受损的患者能产生致死性的感染。随麓化疗、放疗及长期应用免疫抑制剂等兔疫力低下人群及艾滋病(AIDS)患者的不断增多，新型隐球菌感染也越来越常觅。据统计，美垦AIDS患者的掰型隐球藏性脑膜炎的发生率为8-10％，现已成必AIDS患者残亡的

2、第四位原因。荚骥是藏型隐球蓥主要魏致疯因素，浮葵貘戆麓型戆球蓥致瘸力强，不荔枝吞嗽。新型隐球菌通过吸入途径可侵犯全身各种器官，尤以中枢神经系统为重，最赘雩

3、起薪整稳球麓毪藏貘炎。麴不及霹治疗，～冬内豹瘸死率为86％，长鹈病死率近100％。以现有的抗舆菌药物如二性霉素B，5．氟胞嘧啶，氟康唑等治疗新登酶球菌瘸，不仅毒酗作潮大，疗程长，费用高，并且其治愈率仪为65。75％，约有30％的病人复发或无效。目前罄遍认为，防派该病述须积极探讨其它有效途径。目兹遴笼有效豹疫茁霹预茨毅挺隐蘧壤感染，药物疗效亦有隈，霞建硬毒《爨护性疫苗对预防和控制新型隐球菌感染具有重要意义。疫荫的研究工作经历了最裰

4、戆灭活痰蓥，减毒活痰蓥裂1991年熬荚貘．蔽穆菇鬻素联会疫蕾(GXM-TT)。这些疫苗都有一定的保护作用，但都因保护效果不佳，制作过程复杂和成本器贵，来褥蜀簸藤应霜。丙近年来发展越来静DNA免疫技术瑙在疫菌的研铡中山大学硕士学位论史中文摘要上汗辟了一个薪懿途径，较之传统疫菌其蠢安全、简便、可诱导较强翡缩耱免疫应铸等优点。由于新型隐球菌为细胞内感染菌，清除新型隐球菌主要依赖细胞免疫，因此，应用DNA免疫防治新型隐球菌病值得作迸一拶的研究。DNA疫苗在防治其它真菌性疾瘸上取得了较好的效果。2000年，Mandel首先筛选出DHAI藻因并证实其编码蛋白质为新型隐球菌MP主要成馀。MP是薪

5、型隐球葚葵貘重要麴糖蛋囊挠器，霹激发遴发型越竣反或(DTH)，是新型隐球菌墩主要的保护性抗原。DHAl是新型隐球菌保护性抗原熬熬嚣。我科实验室的翁锦生硕士对新型隐球菌的DNA免疫做了一些探讨。他以DHAl基因构建DNA疫麓，实验结采显示重组袋粒免疫小鼠看能诱导特异的免疫_陂答，这种免疫力可以部分保护小鼠，减弱新型隐球菌在体内的感染程度。基于这种情况我们设想可以寻求一种增强DNA免疫的方法来提高新型隐球菌DNA疫越的活性。B7—1(CD80)谰于这方厦的磷究。B7-1为I型跨膜蛋白，主要表达于活化B细胞表面，是重要的淋巴细胞活化鲍第二信号分子之～。B7-1主要共糕激CDS+T缨蕤岛C

6、TL分证，CD4+T缨戆蠢Thl分化，这在维持和增强有效免疫应答中起关键作用。新型隐球菌激活T细胞宙B7努予谖节。这耱共蘩l激信号辩子莛始窥维持T缀藏瘦答是努需豹。因诧，本实验选择B7—1与DHAl凝因构建嵌合重组载体以增强DNA免疫的效果。、研究西舱体矫扩增编码新型豫球菌DHAl基因及共蒯激分予B7．1基因的序列，以构建嵌合重缀质粒，利用DNA免疫技术将煎组质粒DNA意接肌、淀小鼠，观祭其在小鼠体内产生的免疫应答，探索B7．1增强新型隐球菌DNA免疫的效果，以期熊为新型隐球菌鲍DNA痰蕊研豢I提供一定憋实验基础。研究内容包括新型隐球菌DHAl基因及B7-1基因嵌合重组质粒的构建及

7、其DNA免疫鼹部分。，(1．新型隐球菌DHAl基因及BT-1基因的扩增、克隆＼设诗合成两对寡孩营酸零

8、耪，分裂苁新鍪隐球蓠重组葳粒peDNA3-DHAl及含有B7—1基因片段的重组质粒pUCmB7-1TM中特异扩增编码DHAl、B7。l的基因片段；各片段PCR产物经纯化回收、酶切后，逐个定向连接到真核表达载体pcDNA3上，分别缀酶切撩定及DNA序列测定，以确定橡建成功嵌合重缀质粒DcDNA3一B7—1一DHAl。Ⅱ中山大学硕士学位论文中文摘要2．重组质粒pcDNA3-B7-1-DHAlDNA免疫小鼠大量制备pcDNA3．DHAl质粒及pcDNA3．B7—1一DHAl嵌合重组质粒D

9、NA，将其分别溶于生理盐水，调整浓度为1u∥ul。取50只6-8周龄雌性BALB／c小鼠，随机分为pcDNA3．B7．1一DHAl嵌合重组质粒组l8只，pcDNA3一DHAl质粒对照组18只，生理盐水(NS)对照组14只。实验组每只鼠左右后腿肌肉每次各注射50ug嵌合重组质粒，对照组注射等量对照质粒pcDNA3-DHAl及生理盐水，以后每两周注射一次，共免疫3次。末次免疫2周后，每组各取4只小鼠，分别测量两腿足垫厚度后，注射5×103个／50u1热灭活新型隐球菌于小鼠