含信号肽的pcdna3.1（-）-vegf165重组质粒的构建与表达的相关分析

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1、万方数据温州医科大学硕士学位论文SuccessfullyconstructthepcDNA3．1(一)-VEGF165recombinantplasmidcontainingasignalpeptidesequence．About20-25％HEK293transfectedwiththerecombinantplasmidcontainingthesignalpeptideexpressingZsGreen72hlateraftertransfected．About15—20％HEK293transfectedwithoutthesignalpeptidesequ

2、enceexpressedZsGreenaftercultured72h．TheHEK293transfectedVEGF165plasmidthroughlipidosomeexpressedmoreVEGF165thannormalHEK293．TherewerenodifferenceonexpressingVEGF165proteinbetweenrecombinantplasmidcontainingthesignalpeptidesequenceandwithoutthesignalpeptidesequence．ConclusionsItisaeffe

3、ctivemethodtoconstructpcDNA3．1(一)一VEGF165recombinantplasmidcontainingthesignalpeptidesequence．TherecombinantplasmidswiththesignalpeptidesequenceornotwereexpressedmoreZsGreenthannormalcells，evenintheVEGFproteinlevel．However,therewerenodifferenceinthetwotransfectedgroups．Keywordssignalpe

4、ptideepithelialcellvascularendothelialcellgrowthfactorhumanembryokidneyanglogenesls7万方数据温州医科大学硕士学位论文．^_‘．—J‘刖昂随着社会的发展、人们饮食习惯的改变以及人口老龄化的加速，血管疾病已呈逐年增加趋势，特别是下肢动脉粥样硬化所导致下肢动脉缺血己成为了血管方面的主要疾病n1。目前成人外周动脉疾病(PAD)的发病率以及达到3．10％啦、31，而其中约有四分之一的患者是年龄较大或合并有其他脏器功能较差而无法耐受外科手术甚至是介入治疗。PAD主要包括下肢动脉粥样硬化闭塞症(1

5、0werlimbatherosclerosisobstruction，下肢ASO)、血栓闭塞性脉管炎(TAO)和糖尿病足(DF)。轻者主要表现为间歇性跛行，重者可导致截肢甚至死亡，严重影响着人们的生活质量H’53。以致近年来下肢动脉硬化闭塞的治疗进展越来越受到人们的关注。我们知道早期对于下肢动脉的治疗主要是药物保守治疗和外科手术，但药物治疗往往只是效果甚微，而一部分患者又无法耐受手术。近些年随着腔内技术的发展，人们似乎以为微创介入就是下肢动脉硬化闭塞症的根治术，甚至专家们在腔内介入治疗可以作为部分下肢动脉硬化闭塞症治疗的首选方法方面已达成共识哺’。事实表明腔内介入以

6、其安全、微创、可重复性等优势已经和传统的旁路术并驾齐驱。但多年的临床实践结果表明腔内治疗的最大缺陷就在于治疗后的再狭窄，以及对一些微小血管爱莫能助。因此为了更加有效的治疗甚至可以说是根治下肢动脉硬化闭塞症这一难题，除了研发能抑制血管内膜增生相关药物以外，相关领域一直在探索研究有效的基因治疗。ConnollyⅢ在1989年第一次发现一种促进血管内皮细胞形成的蛋白，就是我们今天所提到的血管内皮生长因子(VEGF)。它是目前促进血管再生的最强生长因子之一。VEGF家族中有很多亚型，最为我们熟悉的莫过于表达于人的VEGFl65旧。。关于VEGF在体外促进血管新生的研究已经比

7、较成熟了。当1996年，Isner旧1曾首次运用VEGF基因治疗1例血栓闭塞性脉管炎患者，开创了基因体内治疗的先例。之后关于基因治疗的研究并无实质性的进展n0。心1。随着探索发现早期的基因治疗主要以目的基因裸质粒注射至缺血部位，缺血部位往往也缺氧，而Shima等人u3。发现VEGF在缺氧时半衰期仅有6—8h，这种情况下使得直接注射VEGF基因还没来得及促进内皮祖细胞的分化及血管的新生，自身已完全降解了。近10年人们正在致力寻找一种能在人细胞中持续表达的载体与目的基因重组后注射到缺血部位。目前人们选用重组基因的载体主要有脂质体和病毒两种。有关报道称以腺病毒为载体的