HSP-FLP重组质粒的构建及表达分析-论文.pdf

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1、第33卷第5期怀化学院学报Vo1．33．No．52014年5月JOURNALOFHUAIHUAUNIVERSITYMaY．2014HSP—FLP重组质粒的构建及表达分析屈永贵，陈婷芳，王静，王飞英，吴秀山，邓云(湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙410081)摘要：为了制备用于在斑马鱼中热休克全身表达目的基因的转基因载体，通过分子克隆的方法从P{hsFLP}86E／TM6B转基因果蝇的基因组中克隆出FLP．并同时对HSP—Wnt5A—EGFP栽体进行改造，Wnt5A由FLP代替，并在FLP和EGFP编码区之问插入带有多克隆位点的IRES序列，获得pTol2一HSP—FLP—IR

2、ES—EGFP转基因表达载体．利用得到的转基因载体显微注射到斑马鱼单细胞期胚胎中进行表达分析，结果表明，经热激外源目的基因FLP和报告基因EGFP均能在斑马鱼中表达．pTo12一HSP—FIJP—IRES—EGFP转基因表达载体的成功构建对于建立FIJP，FRT重组系统的斑马鱼转基因实验模型具有重要意义．关键词：HSP；FLP；斑马鱼；转基因中图分类号：Q341文献标识码：A文章编号：1671—9743(2014)5—0033—04斑马鱼具有繁殖能力强，体外受精和发育，性成鱼．通过FLP／FRT位点特异性重组系统构建转基因斑马熟周期短，个体小易养殖，后代繁育数量大，光透性鱼品系

3、，让研究者们能够像在小鼠和植物中那样设计的胚胎，可针对治疗药物进行高通量筛选等诸多特点，一些更加简洁地斑马鱼条件敲除实验．使其成为后基因组时代生命科学研究中重要的模式脊1材料与方法椎动物之一[．随着分子生物学技术不断地发展，基因完全敲除、1．1材料基因条件敲除、基因插入、点突变、缺失突变、染色pTol2一Cmlc2一ires—EGFP、HSP—Wnt5A—GFP质体组大片段删除等基因工程技术也随之而生．像位点粒以及大肠杆菌DH5a菌株为湖南师范大学心脏发育研特异重组属于一种基因条件敲除，位点特异重组是由究中心一80~C保存．质粒小提试剂盒、去内毒素质粒位点特异重组酶介导的DNA

4、重组反应，Cre／loxp和小提试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA公司，pMD18FLP／FRT系统是研究最为详细的两个重组酶系统，并一T载体、DNA连接试剂盒、ExTaqDNA聚合酶购自且越来越广泛的应用于基因的调控和条件敲除_2J．这TaKaRa公司，各种限制性内切酶购自Fermentas公司，两个系统具备无启动子限制、无明显底物偏好、基因大肠杆菌OneShotecdBSurvivalCompetentCells购自调控效果稳定等优点l3J．FLP／FRT位点特异性重组系统Invitrogen公司，一80℃保存．斑马鱼独立养殖系统由于具有比Cre／loxp系统更高的重组效率

5、和靶向性，已(北京爱生)、显微注射仪(HARVARDAPPARATUS)．经被广泛应用于细菌、HIV病毒等微生物和拟南芥、1．2方法水稻、小鼠、大鼠、果蝇、线虫等高等真核模式生物1．2．1pTol2一HSP—FLP—ires—EGFP表达载体的构建的研究中，实现了基因条件敲除、基因插入、点突变、首先挑50个P{hsFLP}86E／TM6B转基因果蝇胚缺失突变、染色体组大片段删除等基因工程操作4J．胎，提取基因组．以其为模板，以FLP—F(5’一3’)：G然而，在模式生物斑马鱼中几乎没有看到FLP／FRT位GGCCTGCAGGACCATGCCACAATTTGA点特异性重组系统的报

6、道．为了相关研究，本实验从TATATTATGT和FLP—R(5’一3’)：GCCCGGGFLP／FRT位点特异性重组系统构建的转基因品系的果AGATCTTTAAATGCGTACTTATATGCG蝇基因组中克隆出FLP序列，构建了FLP的真核表达TcTATT为引物，利用EXTaqPCR扩增FLP序列并载体pTol2一HSP—FLP—EGFP，pTol2一HSP—FLP—纯化回收1300bp的片段．随后将其连接入pMD18一TEGFP可以表达FLP重组酶，并构建了其转基因斑马载体进行转化、提取质粒，酶切、测序鉴定获得正确收稿日期：2014一O1—19基金项目：国家自然科学基金资助项

7、目“人类心脏和肌肉高水平表达基因POP1在心肌肥大中的作用研究”(81170088)；湖南省研究生创新性课题“利用斑马鱼模型研究Trim45基因在血祖细胞形成与分化中的作用”(CX2012B212)．作者简介：屈永贵，1986年生，男，湖南浏阳人，硕士生，研究方向：分子发育遗传学；*通讯作者：邓云，1969年生，男，湖南洞口人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向：心脏发育基因调控机理．·36·怀化学院学报2014年5月慢地开始倾向选择TALEN敲除技术，使之代替Cre／loxp鱼心脏组织特异