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《疏肝益肾方对人乳腺癌tam耐药细胞株的作用机制分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、疏肝益肾方对人乳腺癌TAM耐药细胞株的作用机制分析 乳腺癌是全球女性最高发恶性肿瘤,死亡率仅次于肺癌,位居第二[1].无论国内、国外,每年激素受体阳性乳腺癌患者的比例均占全部乳腺癌患者的一半以上.针对此类患者的首要治疗是内分泌治疗.然而,在内分泌治疗过程中,原发的内分泌治疗抵抗以及药物使用时间过长产生的获得性耐药,严重影响了乳腺癌患者的远期治疗效果.因此,对内分泌耐药的研究已引起越来越多学者的关注,成为当今肿瘤研究的热点之一.疏肝益肾方是我科几代中医名家总结出来的治疗激素依赖性乳腺癌的有效方剂,由柴胡、女贞子等合理冲汤组成,具有疏肝益肾,调理冲
2、任之血(活血)的功能,攻补兼施,祛邪不伤正的作用.本实验就疏肝益肾方对人乳腺癌TAM耐药细胞株(MCF-7TAM-R)的作用及作用机制进行了初步探索. 1材料与方法 1.1细胞株MCF-7TAM-R:对三苯氧胺耐药的乳腺癌MCF-7细胞,由Georgetooxifen)、0.25%+0.02EDTA胰酶消化液(美国Hyclone);牛胰岛素、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma).基因芯片依托上海其明信息技术有限公司代为检测.恒温微孔板快速振荡器由江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司生产;多功能酶标仪由美国Biotek公司生产. 2实验方法
3、 2.1细胞培养将MCF-7TAM-R细胞用无酚红DMEM培养液(含10%胎牛血清,青霉素、链霉素分别为100mg/L、0.01mg/ml胰岛素、10-7mol/LTAM溶液)中,在37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养.倒置显微镜下观察细胞贴壁情况,生长状态良好,待其铺满瓶底70%~80%时,以0.25%胰蛋白酶消化传代,隔日换液. 2.2大鼠含药血清制备①雌性SD大鼠去势:大鼠常规饲养一周后,称重,水合氯醛腹腔注射麻醉,剂量为0.35ml/100g.于大鼠背部切除卵巢,(手术方法参考李仪奎《中药药理实验方法学》[2])缝合后,颈部皮下注射青
4、霉素,并在术后3天连续皮下注射青霉素,防止感染.术后大鼠恢复1周,开始灌胃.②将大鼠随机分为疏肝益肾方高、中、低组、TAM组以及空白组5个组,每组6只.中药组以成人给药的等效剂量的4、2、1倍来进行灌胃,TAM组以成人的等效剂量灌胃,阴性对照组以等量生理盐水灌胃,连续5天.于第5天最后一次灌胃后1小时,经腹主动脉取血,常规离心制备血清,56℃、灭活30分钟,过滤分装后,-80℃保存备用[3]. 2.3CCK8检测细胞抑制率以对数生长期细胞610个/ml铺96孔细胞培养板,24小时后,将各组血清作用于细胞,以上各组的浓度均有DMEM培养液稀释获
5、得,每组设6个平行孔,3个调零孔,每孔200μl.分别在加药后24小时、48小时、72小时、96小时,每孔加入20μl的CCK8培养1小时,用酶标仪检测各孔450吸光度值(OD),按以下公式计算乳腺癌MCF-7TAM-R细胞在各实验条件、不同培养时间细胞抑制率,细胞死亡率=(1-实验组OD450平均值/空白对照组OD450平均值)100%.结果如表1.2.4基因芯片检测疏肝益肾方对MCF-7TAM-R细胞的作用机制根据2.3的实验结果,提取加药处理后48小时的MCF-7TAM-R细胞的总RNA,依托上海其明信息技术有限公司代为检测.
6、 2.5统计学方法采用SPSS17.0软件进行数据分析.结果采用(x-±s)表示,组间比较用方差分析.P<0.05为差异有统计学意义. 3结果 3.1CCK8检测含药血清培养细胞后各组抑制率结果显示:与TAM组相比,疏肝益肾方三个剂量组对TAM耐药细胞48小时,72小时具有不同的抑制作用(P<0.05),尤以疏肝益肾方高剂量组48小时抑制作用最强(P<0.05).见表1. 3.2疏肝益肾方逆转TAM耐药的机制疏肝益肾方对TAM耐药细胞MCF-7TAM-R有一定的作用,能够抑制耐药细胞的生长.为了明确疏肝益肾方
7、对于MCF-7TAM-R产生这些变化的原理和机制,并结合中医复方多靶点作用的特点,我们选择基因芯片倍数法筛选差异基因的方法,对其进行研究.基因芯片结果共筛选出1867个差异基因,其中,表达上调的有1436个基因,基因表达下调的有931个基因. 对上调差异基因进行显着性功能分析,结果发现疏肝益肾方参与血液凝固及蛋白转运等113项过程,对下调的差异基因进行显着性功能分析,结果发现疏肝益肾方参与免疫应答及细胞凋亡的调控等85项过程;而对上调差异基因进行PathJ[11]报道了山葡萄提取的化合物之一的去氢黄柏苷G可以阻断MCF-7TAM-R细胞中PIN
8、1介导的VEGF基因的转录,从而提示去氢黄柏苷G治疗TAM耐药乳腺癌的治疗潜力.我们实验发现,疏肝益肾方作用TAM-R耐药细胞后,VEG
