实时荧光定量RT-PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立.pdf

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1、安徽农业科学，JournalofAnhuiA．Sci．2011，39(31)：19224—19226责任编辑方媛责任校对傅真治实时荧光定量RT．PCR检测鱼类传染性胰脏坏死病病毒方法的建立徐晔，段宏安，周毅，刘亭歧，姚燕林(连云港出入境检验检疫局，江苏连云港222042)摘要[目的]建立Taqman探针荧光定量RT—PCR检测传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)的方法。[方法]选取IPNV病毒的基因保守序列，利用PrimerExpress2．0软件设计引物与探针。以梯度稀释的含有IPNV目的扩增片段的质粒作为标准品，探索定量RT—PCR反应条件。[结

2、果]当标准品浓度在10～10。copies／之间时，标准品浓度()与的关系为Ct=一3．426lgX+4．481，相关系数为0．9998。该法对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)、鲤春病毒血症病毒(SVC)和流行性造血器官坏死病病毒(EHNV)，草鱼呼肠孤病毒(GCRV)，大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(cHsE_214)和虹鳟的核酸都没有扩增反应。I结论l该检测方法灵敏度高，特异性好，可用于鱼类传染性胰脏坏死病病毒的快速定量检测。关键词传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)；荧光定量RT．PCR；Taqman探针中图分类号

3、$941文献标识码A文章编号0517—6611(2011)31—19224—03EstablishmentofReal-TimeRT-PCRAssayforDetectionofⅡ’NVXUYeetal(LianyungangEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Lianyungang，Jiangsu222042)Abstract『Obiective]eaimwastodevelopthedetectionofinfectiouspancreaticnecrosisvirus(IPNV)byreal—ti

4、meRT—PCRassay．[Method]PrimersandprobeweredesignedusingthesoftwarePrimerExpress2．0．，I1heplasmidcontainingthetargetsequencewasconstruc—tedtodetecttllesensitivityandpreparethestandardcurve．Thestandardcurvewaspreparedbasedonthelinearrelationshipbetweenthea—mountofplasmidDNAandcyc

5、lethreshold(Ct)．『ResuhlThelinearrelationshipbetweenvirusconcentration()andCtwasCt=一3．0696+42．246(R=0．9998)．ThemethodwasspecificforIPNVanddidnotreactwithothercomparativefishvirusandnucleicacidofrainbowtrout．『Conclusion1ThedeterminationofIPNVbyreal—timeRT—PCRwithhighsensitivity

6、andspecificitywasaneffectivetoolfortherap-iddetectionofIPNV．KeywordsInfectiouspancreaticnecrosisvirus(IPNV)；RealtimeRT—PCR；Taqmanprobe传染性胰脏坏死病(Infectiouspancreaticnecrosis，IPN)主保存。要危害溪鳟、虹鳟、银大麻哈鱼的鱼苗，急性传染，死亡率达1．1．2主要试剂和仪器。AMV反转录酶等反转录试剂、Taq70％～80％，是一种严重的传染性疾病。IPN最早在北美DNA聚合酶购自上海生

7、工生物公司，ABI7300型荧光PCR和欧洲国家流行，于加世纪80年代传人朝鲜、中国台湾省定量检测仪(美国应用生物系统公司)，GeneQuantpro核酸及东北、山西、山东、甘肃等地，是鱼类进出口检疫的重要检浓度测定仪(美国GE医疗集团)，SIGMA3K15型高速台式疫对象。IPN的病原传染性胰脏坏死病病毒(Infectiouspan—离心机(德国SIGMA公司)。creaticnecrosisvirus，IPNV)属双RNA病毒科双链RNA病1．2方法毒，病毒颗粒呈正20面体，无囊膜，有92个壳粒，直径约501．2．1引物与探针设计。根据Gen

8、Bank上登录的IPNV序～75am，衣壳内包有1～2个片段组成的双股RNA基因，是列，经过同源性分析后，在高度保守区选取基因序列，利用