塞内卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41团体标准T/CVMAX7—2019塞内卡病毒荧光RT-PCR检测方法Real-timeRT-PCRassayfordetectionofSenecavirusA（征求意见稿）CVMA中国兽医协会2019-XX-XX发布2019-XX-XX实施中国兽医协会发布T/CVMAX7-2019前言本标准按照GB/T1.1-2009的规则起草。本标准不涉及相关专利。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：青岛立见诊断技术发展中心、中国动物卫生与流行病学中心。本标准起草人：张志、李阳、

2、孙学强、刘爽、徐烽晔、王永玲、宫枫举、官丽娟、邵钰、李翠翠、李晓成、尼博、于晓慧、王琳、周晓翠。CVMA中国兽医协会-1-T/CVMAX7-2019塞内卡病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了塞内卡病毒实时荧光RT-PCR检测的技术要求。本标准适用于塞内卡病毒的核酸检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB1

3、9489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。3.1SVA：塞内卡病毒（SenecavirusA）3.2实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real-timeRT-PCR）3.3Ct（或Cp）值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Thresholdcycle）3.4FAM：羧基荧光素（Carboxyfluorescein）4仪器设备4.1荧光PCR检测仪。4.2台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。4.3普通冰箱：2℃~8

4、℃。CVMA4.4普通冰柜：中国兽医协会-20℃以下。4.5超低温冰箱：可控温至-70℃以下。4.6微量移液器：0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL，并配备与移液器匹配的吸头。4.7高压灭菌锅。5试剂和耗材5.1试剂5.1.1RNA提取试剂盒5.1.2SVA检测引物和Taqman荧光探针，序列如下：上游引物qSVA-F：5’-CTGCGCTGGGACCGTATCTCA-3’下游引物qSVA-R：5’-CGCCGCGCCACCTCATT-3’-2-T/C

5、VMAX7-2019荧光探针qSVA-Probe：5’FAM-TCGCCGTAAGCGTGCACCGAGACAG-3'BHQ15.1.3阳性对照：灭活的SVA病毒培养物或体外转录的cDNA。5.1.4阴性对照：为已知SVA阴性的猪的组织悬液。5.2耗材5.2.11.5mL离心管。5.2.20.2mLPCR薄壁管或八联管。5.2.310-200μL带滤芯吸头。6样品的采集、保存和运输6.1样品的采集6.1.1水泡液采集典型临床发病动物水泡液用灭菌注射器吸出后装入样品保存管，加青链霉素各1000IU/mL，

6、加盖封口，冷冻保存。6.1.2水泡皮采集用灭菌剪刀剪取水泡皮适量（1g~2g）装入样品保存管，加50%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存。6.1.3全血或血清采集屠宰场猪的全血或血清直接用离心管接取不少于5mL，猪场猪只用无菌注射器抽取静脉血不少于5mL，室温或37℃放置自然凝集20min~30min，2000r/min~3000r/min离心10min，吸取上清液到新的离心管内备用。6.1.4组织样品采集取猪扁桃体、脾脏、淋巴结等主要脏器适量（5g~10g）装入灭菌15mL样

7、品管中，编号，备用。6.2样品的保存上述采集的样品可立即用于检测，不能立即检测的样品，在2℃~8℃条件下不超过24h，-20℃可以短期保存，-70℃以下可以长期保存。CVMA6.3样品的运输中国兽医协会样品的运输必须采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。7实时荧光RT-PCR操作程序7.1样品RNA提取用商品化的RNA提取试剂盒提取样品的RNA，备用。提取的RNA应立即进行实时荧光RT-PCR扩增，如在4℃保存，不宜超过8h，如需长期保存，应放置在-70℃中冰箱中。7.2反应体系的配置在反

8、应配置区进行。每个检测反应体系使用18μL的实时荧光RT-PCR反应液，分别加入制备的RNA溶液2μL，使每管总体积达到20μL，编号，拧紧管盖后，500r/min离心30s。7.3实时荧光RT-PCR反应在检测区进行。在荧光PCR仪上选用FAM通道，设置如下反应参数：-3-T/CVMAX7-201942℃反转录15min，95℃变性3min，然后40个循环（95℃10s，60℃20s），60℃采集信号。8结果判定8.1阈值设定阈值设定原则