广地龙药材DNA提取方法的优选-论文.pdf

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1、时珍国医国药2014年第25卷第6期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2014VOL．25NO．6广地龙药材DNA提取方法的优选马梅，李薇，龚玲，卢瑞珊，韦健红(广州中医药大学中药学院，广东广州510006)摘要：目的建立一种适合于广地龙干燥药材DNA的提取方法。方法参考日皮张标本的DNA提取方法，并对样品预处理、酶解条件、沉淀时间等对影响DNA质量的重要因素，进行了筛选和优化。结果按优选的方法提取的总DNA的含量和纯度完全符合引物扩增分析的要求。结论该提取方法不仅解决了地龙类动物干燥药材DNA提取的难题，而且操作简便实用、DNA提取

2、效率高，所得DNA的质量也满足后期DNA分子鉴定。关键词：广地龙药材；DNA提取；PCRDOI标识：doi：10．3969／j．issn．1008-0805．2014．06．048中图分类号：R282．5文献标识码：A文章编号：1008-0805(2014)06-1404-03ExtractionofTotalDNAfromMedicinalGuangDilongMAMei。LIWei，GONGLing，LURui—shan，WEIJian—hong(GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510006，China)Abstrac

3、t：ObjectiveToimproveandoptimizetheextractionprocessofDNAfrommedicinalGuangDilong．MethodsAnewfeasibleDNAextractionmethodwasavailablebymodifyingandoptimizingtheextractionmethodofDNAfromoldordriedskins．ResultsBymodifyingtheextractionmethodofDNAfromoldordriedskins．thecontentandpurityoftotalDNAwere

4、alluptothestandardsforPCRanalysis．ConclusionAsimpleandfeasibleextractionprocessofDNAfrommedicinalGuangDilongwascrea—tedandthecontentandpurityoftheDNAextractedinthismethodcanmeettherequirementsforDNAmolecularidentification．Keywords：MedicinalGuangDilong；ExtractionofDNA；PCR参环毛蚓Pheretimaaspergillu

5、m(EPerrier)属钜蚓科动物，药超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，微量移液器材习称“广地龙”，是《中国药典》收载的4个来源之一，被业内公(Eppendof)：O．5～10p．1，10～100~1，100～lO001xl。认为品质最优者。然而，已知全世界的蚯蚓有两百多种⋯，导致1．2药材试验所用材料为广地龙的干燥药材(见表1)，经广州市场上地龙品种混杂，质量参差不齐，严重影响临床疗效并给患中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定均为广地龙原动物钜者留下安全隐患。地龙类动物药材经炮制后，其形态特征会产生蚓科参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E．Perrie

6、r)。较大变化，使物种鉴定的准确性大大降低。近年来，利用分子生表1地龙药材来源物学技术，被认为是解决动物药真伪鉴定的最佳方法。然而应用该技术的重要前题，也是长期困扰人们的难点之一就是如何获得优质的DNA模板。本文以广地龙药材为切入点，根据陈旧皮张标本的DNA提取方法，从药材的浸泡时间等方面探讨影响广地龙药材DNA提取的因素，进一步优化广地龙药材DNA提取1．3试剂的条件，使之满足PCR扩增的要求，以期为DNA分子标记方法1．3．1购置试剂蛋白酶K(美国Merk，北京普博欣公司)，Taq在广地龙药材鉴定中的应用提供必要的物质基础。酶(上海生工)、dNTP(上海生工)，PCR引物(北京

7、华大生物公1仪器与材料司)，琼脂糖(AMERSCO进口，北京普博欣公司)，DNA提取试剂1．1仪器PCR仪(PTC一200，伯乐公司)，自动凝胶成像系统，盒(百泰克生物技术有限公司)，DNA纯化试剂盒(百泰克生物技DJ1000电子精密天平(日本岛津)，JY—C电泳仪(北京六一仪术有限公司)，DNAMarker：DL2000(北京普博欣公司)，GoldView器厂)，JY—SP—C电泳槽(北京六一仪器厂)，核酸蛋白检测仪染料(北京赛百盛基因技术有限公司)，十二烷基磺酸钠