冠突散囊菌DNA提取方法的比较-论文.pdf

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1、福建轻纺2014年1月第l期冠突散囊菌DNA提取方法的比较魏国美，韩涛，许任伟，赵晨，邱希斌(1．福建省产品质量检验研究院；2．国家加工食品质量监督检验中心，福建福州350002)摘要：为寻找一种良好的提取冠突散囊菌基因组DNA的方法。实验以冠突散囊菌(CGMCC3．0462)标准茵株为研究材料，比较不同方法提取冠突散囊菌的基因组DNA的效果差异，再利用DNA浓度测试、琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增3种手段比较DNA-~取的效果。结果显示：600W超声破壁和液氮研磨破壁提取的冠突散囊菌基因组DNA杂质含量高。N200W的超声功率无法破碎冠突散囊茵细胞壁，无法提gKDNA。400W超

2、声破壁提取的DNA的浓度较大、纯度高、效果好，适用于冠突散囊茵基因组DNA的提取。但400W超声破壁、600W超声破壁和液氮研磨破壁3种方法提取的基因组DNA均达~]PCR实验的要求。关键词：冠突散囊菌；超声波；DNA提取cloi：10．3969~．issn．1007—550x．2014．01．002中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1007-550X(2014)01-0043-05属于我国六大茶类之一的黑茶，经过紧压后突散囊菌(Eurotiumcristatum)，属于真菌中的散囊制成再加工茶，称为砖茶。“茯砖茶”是其中很菌属，为一种小型的丝状真菌。科研和临床证重要的

3、一种砖茶，它是目前茶树品系中极为罕见明，茯砖茶中的冠突散囊菌有较强的降脂降压、的原始优良品系，是茶树育种的宝贵遗传资源。调节糖类代谢等功效。因此受到国内外科研工作茯砖茶作为边区人民预防疾病的主要复方制剂以者的广泛关注。及生活中维生素、微量元素的重要来源，越来越受现在随着分子生物学在微生物检测中的普到人们的重视。在茯砖茶成品的茶叶表面普遍存及，国内外学者也尝试利用这些新技术对冠突散在一种俗称“金花”的金黄色小点，是由一种真囊菌的鉴定进行了研究。主要是利用RFLP(限制菌形成的闭囊壳堆。而“金花”是茯砖茶成品中性内切酶片段多态性分析)、真菌的18SrDNA或的优势菌群。目前经过多方

4、论证和鉴定可以确ITS片段分析等手段，寻找不同种属在基因上的差定，“金花”中的优势种群和主要的益生菌为冠异，探寻适合于冠突散囊菌的分子生物学分析技收稿日期：2013—10—21作者简介：魏美国，男，高级工程师。《福建轻纺》43魏国美等：冠突散囊菌DNA提取方法的比较术，而RFLP、ITS等分析技术需要获得冠突散囊1．2冠突散囊菌菌丝球的培育菌的基因组DNA，而目前关于冠突散囊菌基因组将冠突散囊菌标准菌株冻干粉接种于lOOmLDNA提取的国内外报道较少。刘石泉等人[1】以溶无菌马铃薯葡萄糖液体培养基中，于28oC、菌酶破壁法、纤维素酶破壁法、果胶酶破壁法、200rpm．min的条

5、件下震荡培养7d，之后挑取一CTAB法、SDS法等6种方法提取冠突散囊菌的基个菌丝球作为菌种，按上述方法转接3代后收集因组DNA，发现SDS法提取效果最好。王勇[2]等培养基中所有的菌丝球，滤干水分后均分为4份，人选取8种方法(破壁酶消解法、超声破碎法、用于后续基因组DNA的提取。-80~(2冻融法、高盐溶液法、尿素溶液法、CTAB1．3基因组DNA的提取法、改良CTAB法、试剂盒法)提取绿色木霉基取3份菌丝球分别加入10mL基因组提取试剂因组DNA，发现试剂盒法的DNA提取效果较好。盒的BuferLP1溶液(新型植物组织基因组提取试超声波是物质介质中的一种弹}生机械波，具剂盒

6、，康为世纪生物科技有限公司)，在冰浴条有波动形式和能量形式，当达到一定剂量的超声件下于超声波细胞粉碎机(JY92一IIN型，宁波新波在生物体内传播时，通过它们之间的相互作芝生物科技股份有限公司)上超声破壁，超声破用，能引起生物体的功能和结构发生变化。超声壁的时间为1min，工作5S、间隔5S，超声功率分波对细胞可产生有热效应，空化效应和机械效应别设为200、400、600W。超声破壁之后的操作等3种作用，致使细胞损伤破碎。损伤的强弱与步骤按产品说明书进行，共得到3份DNA样品，超声波的频率和强度密切相关。将超声破用于破分别标号为：①、②、③，与上述的超声功率对碎细胞是近年来新兴

7、的方法，它耗时短、操作简应。另取一份菌丝球，液氮充分研磨后加入10mL单。因此实验以冠突散囊菌(CGMCC3．0462)BufferLP1溶液，后续步骤按产品说明书进行，标准菌株为研究材料，比较不同超声破碎条件下得到1份DNA样品，标号为④。提取冠突散囊菌基因}~DNA的效果差异，以期寻采用上述方法共得到4份DNA样品(①、找一种良好的提取冠突散囊菌基因组DNA的方②、③、④)，用于后续分析。法。1．4DNA浓度测试1材料与方法取2uLDNA$~品注入48L去离子水中，涡旋1．1材料混匀并离