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1、·18·中药新药与临床药理1999年1月第10卷第1期方法与技术交流论文编号:1003-9783(1999)01-0018-20植物中药材总DNA提取方法的比较王培训 黄 丰 周 联 曹柳英 梁瑞燕广州中医药大学临床药理研究所,广州510405摘要:随机扩增多态性DNA(RAPD)技术已经应用于中药材的鉴别,如何从多种中药材提取到总DNA来进行相关性研究是一个关键的课题。从植物中提取基因组DNA的方案众多,其中较为流行的方案有三类:(1)用苯酚-氯仿(变性蛋白)作为提取介质。(2)用CTAB(既能裂解细胞壁,又能去除多糖)作为提取介质。(3)用高盐低pH介质作为提取介质(有效
2、的蛋白沉淀剂)。经过比较,我们认为第(3)套方案快捷、经济,比较适于基层单位应用。主题词:DNA/分离和提纯;@随机扩增多态性DNA技术/利用;中药鉴定分类号:R282.5;Q503;Q781文献标识码:A 市售中药材大多为干品,而中药材的加工制),其余试剂均为国产分析纯。-1和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利缓冲液A(50mmol·LTris-HCl,pH-1-1于DNA的完整性,如何从市售的植物中药材8.0,10mmol·LEDAT,5mmol·Lβ-巯中简单、快速取得适合RAPD分析的DNA来基乙醇,2%SDS)。-1进行相关研究是一个有待解决的问题。从新缓冲液
3、B(100mmol·L醋酸钠,-1-1鲜植物细胞基因组提取DNA的技术较为成50mmol·LEDTA,500mmol·L氯化钠,熟,方法众多。这些方法是否适用于市售干品2.5%PVP,3%SDS,1%β-巯基乙醇,中药材基因组DNA的提取,为此,我们对常用pH5.5。-1于提取植物DNA的三种方法进行了比较,并缓冲液C(50mmol·LTris-HCl,pH-1-1对相关问题进行了讨论。8.0,10mmol·LEDTA,0.7mol·LNaCl,1 材料与方法1%β-巯基乙醇,1%CTAB)。-11.1中药材样品 本实验采用两个产地的西缓冲液D(10%CTAB,0.7mol·
4、LNa2洋参(根部)和布渣叶(叶片)作为分析的材料,Cl)。-1其中威斯康星西洋参(干品,存放5年),西安缓冲液E(10mmol·LTris,1mmol·-1西洋参(干品,存放6年),由广州市药品检验LEDTA.pH8.0)。所谢培山教授赠送,新鲜布渣叶,布渣叶(干1.3 主要仪器 低温高速离心机(Beckman品,存放3年)来自本校药圃,并由本校中药鉴GS-15R);紫外/可见光分光度计(Pharma2定室鉴定。cia4000);凝胶成像仪(UVPGDS7600G);1.2试剂 Tris(B.M.)β,-巯基乙醇(ª‹低温恒温式电泳仪(LKB);纯水器(Milli2Ƀ¦™
5、•株式会社),SDS(Serva),PVP(聚乙poreQ-R)。烯吡咯烷酮,BASF),CTAB(十六烷基三甲基1.4 样品总DNA提取方法[1]溴化铵Farco),琼脂糖(Promega),溴化乙锭1.4.1苯酚法 根据内宫博文等的方法(EB,Sigma),RNase(Promega),玻璃砂(自加以改进。①称取0.2g各中药材样品分别用基金来源:卫生部科研基金。中药新药与临床药理1999年1月第10卷第1期·19·液氮(Ⅰ)、玻璃砂(Ⅱ)、氧化铝(Ⅲ)研液D,于室温下放置15min,再用等体积氯磨粉碎。②将粉末放入10mL离心管中加入仿-异戊醇(24∶1)抽提1次。④上
6、清液加5mL缓冲液A,混匀,37℃放置过夜。③于入缓冲液C于室温下放置6h(或过夜)。⑤10℃、10000g离心10min。④取上清液添加12000g离心25min,吸去上清液,用70%等体积的水饱和酚溶液(pH8.0),反复混乙醇洗沉淀两次,加入150μL缓冲液E,存匀,室温下作用30min。将混合液移入聚乙于4℃备用。烯离心管,于4℃、10000g离心20min。将1.5 电泳检测 取10μL提取的DNA溶液上层水溶液取出。⑤先用酚-氯仿-异戊醇与溴酚蓝2.0μL(0.25%溴酚蓝,40%蔗糖(25∶24∶1),再用氯仿-异戊醇(24∶1)抽提水溶液)混匀点入1.5%琼脂
7、糖上,用1×各1次直至无白色中间层。⑥将上清液移入TAE电泳缓冲液在3V/cm下电泳。用EB-1离心管,加入等体积异丙醇混匀,放入(溴化乙锭0.5mg·L)染色30min。-20℃冰箱45min,于12000g离心25min,2 结 果得到的沉淀用70%乙醇洗2次。⑦将沉淀溶2.1DNA纯度及产率取40μLDNA溶液于150μL缓冲液E,存于4℃备用。稀释50倍后,用紫外/可见光分光光度计测1.4.2高盐、低pH法(以下简称低pH定A260及A280值。DNA纯度按A260/[2]法)根据邹氏等的方法加
