纳豆芽孢杆菌rocG基因和ure基因敲除载体的构建-论文.pdf

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1、第31卷第5期上海交通大学学报(农业科学版)Vo1．31No．52013年lO月JOURNAlOFSHANGHAIJIA()TONGUNIVERSITY(AGRICUITURAISCIENCE)()ct．2O13文章编号：16719964(2013)05—0016O4D0I：10．3969／J．ISSN．1671—9964．2013．05．004纳豆芽孢杆菌rocG基因和基因敲除载体的构建黄蓓，吴旭蕾，钱炳俊张建华(ix海交通大学农业与生物学院，上海200240)摘要：rocG基因和ure基因分别编码纳豆芽孢杆菌中2个与产氨相

2、关的酶一一谷氨酸脱氢酶编码和尿素酶。为构建这2个基因的敲除载体，通过PCR分另tl获得了2个靶基因的上下游旁邻片段和抗性筛选基因nisI。将上游旁邻片段、nisI和下游旁邻片段按次序克隆到革兰氏阳性菌基因组整合质粒pMUTIN4q-。限制性内切酶酶切图谱分析及测序结果显示成功构建了纳豆芽孢杆菌rocO基因和rP基因的敲除载体pMUTIN4一rocG：：nisI和pMUTIN4一ure：：nisI。该质粒的构建，为同源重组获得低产氨纳豆芽孢杆菌工程菌株奠定了基础。关键词：纳豆芽孢杆菌；rocG；ure；基因敲除载体中图分类号：T

3、$201．3文献标识码：AConstructionofKnock—OutVectorsforrocGGeneandureGeneinBacillussubtilisNattoHL，ANGBei，WUXu—lei，QJANBin-jun，ZHANGJianhua(SchoolofAgricaltureandBiologyShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200240，China)Abstract：rocGgeneanduregenecodeglutamatedehydrogenase(GDH)

4、andurokinaseinBacillussubtilisnatto，respectively．Bothoftheenzymesplaykeyrolesinammoniaproduction．Toconstructknock-outvectorsofthesetwogenes，flankingsequencesoftwotargetinggenesandresistancegenenisI，whichcanbeusedforscreening，wereclonedintopMUTIN4，anintegrativevector

5、forgram-positivesgenornics．Theorderofthereconstructedsegmentwasupstream。nisIanddownstream．RestrictionendonucleaseanalysisandDNAsequencingshowedthattherecombinantknockoutvectorspMUTIN4一rocG：：nisIandpMUTIN4一ure：：nis1wereconstructedsuccessfully．Theseknock-outvectorscan

6、beusedtoconstructaGDHorurokinasedeletionB．subtilisnattomutantbyhomologousrecombinationtoreducetheammoniacontentofnatto．Keywords：BacillussubtilisNatto；rocG；ure；knock-outvector纳豆是以大豆为原料，用纳豆芽孢杆菌在肠道中稳定性好，既可静脉给药，又可口服Ⅲ。因(BacillussubtilisNatto)发酵而成的功能性食品。此，纳豆可有效预防心血管疾病。纳豆在

7、发酵过程中产生了丰富的纤溶蛋白酶纳然而，纳豆发酵过程中产生的氨臭味，严重影响豆激酶(nattokinase)，其分子量小，无免疫原性，能了其风味和我国消费者对产品的接受度。张建华抑制血栓形成，且溶血栓作用强。该酶抗胰酶水解，等从商品纳豆中分离获得l株纳豆激酶活性高的收稿日期：20121211基金项目：国家自然基金项目(31171737)作者简介：黄倍(1988一)，女，硕士生，研究方向：食品微牛物，Email：huangbei．1988@163．corn；张建华(1g68_)为本文通讯作者，男，Ig~，副研究员，研究方向：食品

8、微生物，E-mail：zhangih@situ．edu·CIA第5期黄蓓，等：纳豆芽孢杆菌rocG基因和ure基因敲除载体的构建17纳豆芽孢杆菌(CGMCCNo．2801)，但在其发酵的1．1．1菌株、质粒、培养基和生长条件纳豆产品中产氨量为347．7±24．31mg／kg。