纳豆激酶基因的克隆和高效表达-论文.pdf

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1、安徽农业大学学报，2012，39(4)：556．559JournalofAnhuiAgriculturalUniversity网络出版时间：2012．7．417：47：40[URL]http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1162．S．20120704．1747．019．html纳豆激酶基因的克隆和高效表达王伟，甘露，甘旭华，陈晓琳，倪敬田，唐欣昀(安徽农业大学生命科学学院，合肥230036)摘要：为了克隆纳豆激酶(Na~okinase，NK)基因，实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达，并对其表达条件进行研究，首先以从枯草芽孢杆菌中提取

2、的基因组DNA为模板，通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因，将其克隆到载体pET28a中，构建重组质粒pET28a-NK，成功转化大肠杆菌BL21(DE3)；然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明，重组菌株BL21(DE3)．NK在20℃下培养、IPTG添加量为0．4mmol·L。。、培养20h时表达产物的纤溶活性最大，可达到81．73U·mL～，SDS—PAGE检测观察到1条38kDa的蛋白条带，与预期相符。关键词：纳豆激酶；枯草芽孢杆菌；基因克隆；表达中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：1672

3、—352X(2012)04—0556—04Cloningandhigh-efficiencyexpressionofnattokinasegeneWANGWei，GANLu，GANXu-hua，CHENXiao—lin，NIJing—tian，TANGXin—yun(SchoolofLifeScience，AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036)Abstract：Inthisstudy,thenattokinasegenewithsignalpeptide，propeptideandmaturepeptidewasclo

4、nedandexpressedinEscherichiacoli．andtheinductionandexpressionparameterswereoptimized．ThegenewasamplifiedwithgenomicDNAextractedfromBacillussubtillisastemplatebyI1-PCR，digestedandligatedwithexpressionvectOr_DET28atoconstructrecombinantplasmidpET28a．NKwhichwastransformedintoEcolistrai

5、nBL21(DE3)．Inductionconditionssuchastime，temperatureandIPTGconcentrationwerestudied．andthehigh．estfibfinolyticactivitywasobtainedanditcouldreach81．73U·mL。。whenrecombinantstrainBL21rDE3)一NKwascultivatedat20℃for20hwithIPTGat0．4mmol·L一．Anexpectedproteinbandabout38kDawasobservedbySDS—PA

6、GE．Keywords：nattokinase；BacillussubtillPs；geneclone；expression纳豆(natto)是具有一定生理功能的保健食化纳豆激酶的纯化方法等【6{]手段；Nakamura等人品⋯。1987年Sumi[21首次从纳豆中分离出一种具有于1992年公布了纳豆激酶基因序ydt，使得利用基溶栓功能的纳豆激酶(Nattokinase，NK)，该酶是由因工程方法生产纳豆激酶成为可能。目前大多数学枯草芽孢杆菌(Bacillussubtile)的一个亚种一纳豆者选择克隆含有前导肽和成熟肽[10-12域者只含有成芽孢杆菌(Baci

7、llusnatto)发酵产生的一种具有强烈熟肽[13-14]的纳豆激酶基因片段，但都存在表达出的溶栓功效的碱性丝氨酸蛋白酶【3】，当纳豆激酶被口酶活性不高甚至没有活性的问题。本试验利用PCR服时，纤溶活性会提高，并且在血浆中能够持续很方法获得含有信号肽、前导肽、成熟肽的前纳豆激长时间【4]。鉴于纳豆激酶的食物背景、强烈的纤溶酶原基因，成功构建原核表达载体pET28a-NK，使活性以及在肠胃中的稳定性，使得它比市场上的其重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物具它商用药物都具有优势L5J。为了获得大量的纳豆激有较高纤溶活性，为纳豆激酶的工业化生产提供试酶，国内

8、主要采用改善纳豆杆菌液体发酵条件、优验