内生生防菌336X遗传敲除体系的构建.pdf

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1、CONSTRUCTIONOFGENETICKNoCKOUTSYSTEMBYENDOPHYTICBACTEIUA36XWITHBIoLOGICALCONTROLABILITYADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByZhangHaiYanSupervisor：A．P．WangGangMay,201关于学位论文

2、独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。学位申请人(学位论文作者)签名：：毯盎燕2011年占月fg日关于学位论

3、文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文(纸质文本和电子文本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、；r-编学位论文(纸质文本和电子文本)。(涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书)学位获得者(学位论文作者)签名：这盎煎2011年≥只}8B学位论文指导

4、教师签名：201／年上月协摘要植物内生细菌是指能定殖于健康植物组织内部，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物。植物内生细菌具有促进植物生长，提高植物抗逆性等能力。目前，植物内生细菌的研究现已成为国内外研究的一大热点。利用小麦内生细菌防治植物土传病害逐渐以安全、有效等优点得到各国植病学家的广泛关注。生防菌生防机理的研究有助于开发稳定、高效、易保存的生防制剂，为大田应用奠定理论基础。分离生防相关基因，从分子水平上研究基因的功能，是阐述生防菌的生防机理的重要途径。本研究中所用的小麦全蚀病内生生防菌Serratiap

5、roteamaculans336X是由本实验室从小麦根部分离得到的革兰氏阴性细菌，对小麦全蚀病的防效可达85％。内生生防菌336X具有产几丁质酶、蛋白酶等病原菌细胞壁降解酶的能力，也可以通过产生N．乙酰．高丝氨酸内酯(AHL)群体感应信号分子形成生物薄膜、铁载体、诱导系统抗性等途径发挥生防作用，并且能够在小麦根部高效定殖，具有运动性和趋化性等生防相关特征。为了研究内生生防菌336X的生防相关基因的功能，从而深入了解其发挥生防作用的分子机制，本研究从两个方向出发，一方面通过利用果聚糖蔗糖酶编码基因sacB表达时33

6、6X菌株对蔗糖的敏感性作为反向选择标记，构建小麦内生生防菌336X的环状载体遗传敲除体系，对与内生菌336X发挥生防作用相关的鞭毛运动性基因motA进行基因敲除，最后得到了4个motA基因的敲除突变株。同时，利用该方法对与336X菌株中趋化性相关基因CheW进行基因敲除，最后得到了3个CheW基因的敲除突变株，为该体系的可行性提供了有力的证据。另一方面，利用Red重组系统构建了小麦内生生防菌336X的线性载体遗传敲除体系。首先对内生生防菌336X进行了遗传改造，得到了工程菌336X．1，使得线性载体在336X．1

7、中能够发生同源重组，并对工程菌336X．1进行了温度敏感性测定。进一步构建了内生菌336X产几丁质酶相关基因幽谢的线性打靶基因片段CI-Km．C1，通过电击转化的方法将以上线性打靶基因片段导入到工程菌336X．1中，得到了2个几丁质酶A基因的敲除突变株。同时，构建了内生菌336X假定的植酸酶基因的线性打靶基因片段phy．Km．phy，利用该方法进行基因敲除，最后得到了4个p砂基因的敲除突变株，为该I内生生防菌336X遗传敲除体系的的构建体系的可行性提供了有力的证据。最后，对两种敲除体系进行了比较，分析了它们各自的

8、优缺点。以上研究为研究内生生防菌336X的生防相关基因的功能，进一步认识其生防作用的分了机制奠定了理论基础。关键词：内生细菌，Red重组系统，基因敲除，生防机理IlAbstractEndoph”icbacteriareferstoakindofmicrobialthatCallcoloniseinthehealthyplanttissueandestablishtheha