黄酒酵母菌基因变异及其基因敲除突变菌株的构建

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1、万方数据DissertationSubmittedtoZhejiangGongshangUniversityforMaster’SDegreeofEngineeringANALYSISOFGENETICVARIATIONSANDCONSTRUCTIoNoFKNOCKOUTMUTANTSOF黝oC：删露们夕MCE譬C毒淑层纥鬟纠ERICEWINESTRAINAuthor：阮wen物Major：FoodScienceandEngineeringSupervisor：Prof．XinleLiangAssociateProf．Yudong

2、LiJan．2015CollegeofFoodScienceandBiotechnology,ZhejiangGongshangUniversityHangzhou，310035，China万方数据浙江工商大学硕士学位论文黄酒酵母菌基因变异及其基因敲除突变菌株的构建摘要黄酒是中国的民族特产，主要以大米、玉米、小麦等为主要原料，利用麦曲中的多种微生物发酵而成的酿造酒。黄酒含有丰富的氨基酸、维生素和矿物质，具有易于消化，舒筋活血、美容抗衰老、促进食欲、保护心脏等功能。在黄酒发酵过程中，酿酒酵母(Saccharomycescerevis

3、iae)是其中的关键微生物对发酵起主导作用。在黄酒发酵过程中，酵母细胞会受到高温、高渗透压、低pH等环境因子的胁迫，当胁迫条件超过酿酒酵母的生理极限时，就会抑制细胞的正常生长代谢及酒精的发酵效率。因此黄酒酵母对环境胁迫的耐受机理的研究对黄酒发酵工业至关重要。本研究前期已经筛选出一株具有高耐受性的黄酒酵母，并分离获到其单倍体D2。通过对这一株具有优良抗逆性能的黄酒酵母菌的基因组进行测序，并与模式实验菌株$288c进行比较分析，鉴定出了一些在黄酒酵母菌中存在，但不在实验菌株$288c存在的新基因，例如新基因95170。同时也鉴定出黄酒

4、酵母中缺失的一些基因，例如AADl0基因。为了研究新基因95170对菌株发酵及乙醇耐受性的影响，本研究利用Cre／loxP系统构建此基因的敲除菌株，并对基因敲除菌株与原始T万方数据浙江工商大学硕士学位论文菌株进行耐受性比较分析。实验通过扩增带有95170基因上下游同源序列和Kan。筛选标记的95170基因敲除组件，转化到酿酒酵母D2获得阳性克隆子，然后将质粒pSH65转到阳性克隆子中，半乳糖诱导pSH65表达Cre酶切除Kanr筛选标记，获得95170等位完全缺失菌株D2-A95170。耐受性分析表明两菌株对高温和高糖的耐受性相同

5、，但对高浓度乙醇，原始菌株D2比基因敲除菌株D2一A95170表现出较高的耐受性。菌株生长曲线比较结果也表明D2．A95170比D2对高浓度酒精环境的耐受性低。为验证基因敲除菌株对乙醇胁迫耐受性的影响，进一步比较基因敲除菌株与原始菌株在8％乙醇作用不同时间后的存活率。在乙醇处理2，4，6，8小时后，基因敲除菌株相对原始菌株的存活率都降低了约1．16．1．71倍。同时模拟黄酒发酵实验结果表明，缺失菌株D2一A95170的生长与乙醇产量与原始菌株相似。综上结果表明新基因的功能与菌株适应乙醇胁迫有关，但对菌株的生长与发酵性能影响不大。关

6、键词：黄酒酵母，新基因，基因敲除，胁迫耐受性万方数据浙江工商大学硕士学位论文ANALYSIS0FGENETICVARIATl0NSANDCONSTRUCTIONOFKNOCKOUTMUTANTSOF删CC删R伪删C!脚凇泐ERJCEWn也STRAINABSTRACTThericewine(Huangjiu)istheChinesenationalalcoholbrewery．Itisbrewedbyusingthemainrawmaterials，suchasrice，corn，wheat，andavarietyofmicroor

7、ganismsinthewheatkoji．Ricewine，richinaminoacid，vitaminsandtraceelements，hasthefunctionofeasilydigestible，relaxingtendonactivatingblood，maintainingappetiteandprotectingheart。Saccharomycescerevisiae，asthekeymicroorganism，playedaleadingroleinthefermentation。Inthefermenta

8、tionprocessofficewine，yeastcellsaresubjectedtostressofvariousenvironmentalfactors，suchastemperature，osmoticpressure，pH，andet