变形斑沙雷氏菌336X生防相关基因phy的克隆、功能分析及原核表达.pdf

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1、CLONINGFUNCTIONALANALYSISANDPROKARYoTICEXPRESSIONOFBIoCONTROL．RELATED尸月yGENEINSeR剃刀么PRoTEAMACULANs336XADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmemoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByMahaihaoSupervisor：A．P．WangGangMay,2011关于学位论文独创声明和学术诚信承诺IIIIIIIr

2、llmItIIllY1909236本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在此本人郑重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为，文责自负。学位申请人(学位论文作者)签名：墨盘墨2011年5月18日关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予硕士学位。

3、作为学位论文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文(纸质文本和电子文本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手段保存、汇编学位论文(纸质文本和电子文本)。(涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书)学位获得者(学位论文作者)签名：墨盗墨2011年5月18日学位论文指导教师签名：2011年5月18日摘要变形斑沙雷氏菌(Serratiaproteamaculans)336X菌株能抑制由子囊菌

4、禾项囊壳小麦变种(Gaeumannomycesgraminisvar．tritici,Ggt)侵染根部所引起的小麦全蚀病(take—allofwheat)，具有开发成生防制剂的潜力。从分子水平上探索336X的生防机制，研究生防细菌与植物之间的相互作用，具有重要的理论和现实意义。在本研究中，用变形斑沙雷氏菌568菌株基因组中一个预测的ABC转运系统相关基因设计引物phyF／R，以336X基因组DNA作为模板，通过PCR扩增出全长1569bp的完整ORF片段。扩增片段用载体pMD．18T克隆，经过测序分析，发现该片段和568菌株预测的4'-phytase同源，同源性指数为94％，

5、故将该基因命名为phy。保守域序列分析表明，预测氨基酸序列和周质可溶性结合蛋白家族II(PBP2NikADppAOppAlike7)同源，相似性达15．21％。通过信号肽预测程序SignalP3．0Server分析，发现在N端有一段31个氨基酸的信号肽序列，成熟肽链可能在27．28位氨基酸处切开。为了研究phy的功能，将phy片段插入自杀性载体pKAS32，并用卡那霉素抗性片段中断，构建同源双交换敲除载体pKAS2-phy．km。通过接合作用将该质粒从大肠杆菌(Escherichiacoli，E．coli)S17．1导入336X中，PCR检测得到3株phy缺陷型突变株。通过一

6、系列的表型实验，发现突变株摄取Ni2十的能力下降，表明phy可能编码Ni2+运输过程中的Ni2+结合蛋白组分。同时发现突变株的生防能力下降，对小麦根部分泌物的应答减弱，在小麦根表的定殖数量减少。这些结果可能有助于我们分析336X的生防机制。为了进一步研究p砂性质，将phy的ORF序列插入pET-30a中构建异源表达载体pET30a-phy，将该载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果发现经过异丙基．13．D．硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，一个约60kD的重组蛋白得以表达。对诱导条件进行了优化，发现最适的条件为：0．5mmol／LIPTG于28℃下诱导5h。表达

7、的包涵体蛋白通过超声破碎、6mol／L盐酸胍溶解后，变性条件下用Ni2+-NTA亲和柱纯化，及梯度复性得到可溶性蛋白。本研究为蛋白的序列分析，结构鉴定及活性部位研究等奠定了基础。关键词：变形斑沙雷氏茵生防机制基因克隆原核表达IIABSTRACTSerratiaproteamaculans336Xcanagainsttake·alldiseaseofwheat,whichiscausedbyGaeumannomycesgraminisvar．tritici(Ggt)．Itisapotentialbiolo