淇河鲫H2A与Ca-L-hipposin克隆和特征分析及其对细菌感染的表达响应.pdf

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1、THESTUDYOFCLONINGCHARACTERISTICANALYSESANDEXPRESSl0N0FRESPONSE0FABACTERIALINFIECTl0NINC么尺厄赔，(压彳【侬U丁乙靥INOIHERIVERBOTHOF刀2么ANDCA．L．HIPPOSINADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByWuXiangminSupervis

2、or：Prof．KongXianghuiMay，2014摘要lIIIIIIIIIIIlUlIIIIIIIIIIIIIY2550695目前，水产养殖中抗生素的广泛使用，导致病原微生物耐药性的提高，抗生素富集与残留，从而给水产品安全和人类健康带来风险。寻找高效、安全、广谱新型抗菌制剂替代传统抗生素迫在眉睫。抗菌肽是潜在的抗生素替代品，耐高温，具有广谱的抗菌活性，而且病原微生物不易产生耐药性。目前抗菌肽已经在医学、畜牧养殖和食品保鲜等领域开始使用。到目前为止，已经报道的抗菌肽有1000余种，大多为两亲性阳离子a．螺旋结构抗菌肽，而鱼类抗菌肽的研究相对较少。本研究基于GenB

3、ank中登录的H2A保守区域，采用Primer5设计组蛋白H2A简并引物。以淇河鲫(CarassiusaurutusinQiheRiver)肌肉提取总RNA为模板、采用RT．PCR方法克隆H2A编码区序列，通过胶回收和连接到载体，然后转化到JM一109大肠杆菌中进行克隆测序，最后成功获得组蛋白H2A编码区序列364bp。采用相同方法克隆青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(Aristichthysmobilis)组蛋白H2A基因序列。在

4、线软件分析发现均属于不稳定点蛋白质，平均亲水性范围为．0．179～．0．264，PI值范围为10．48～11．02。用DNAman分析淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙组蛋白H2A编码区基因同源性达到93％，氨基酸同源性达到99％。淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙基因与狭孔金线鲤(Sinocyclocheilusangustiporus)同源性达92％，同斑马鱼(Daniorerio)同源性为83％。相比较五种鱼氨基酸与狭孔金线钯同源性为98％，同斑马鱼同源性为91％，与其他物种的同源性偏低。淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙H2AN．端第2--一52位(除去第1位甲硫氨酸)与庸鲽(Hip

5、poglossushippoglossus)hipposin抗菌肽51个氨基酸相对应，同源性极高。庸鲽hipposin抗菌肽不存在任何酸性氨基酸，为带15个正电荷的碱性抗菌肽，但是淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢、鳙第1位的半胱氨酸被丝氨酸取代，第4l位的组氨酸被谷氨酸取代，，显示其电荷量为+14的阳离子，空间结构模型显示为0t螺旋结构抗菌肽。用ExPaSy里的切割工具预测该淇河鲫组蛋白H2A可以被胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶等52位水解成短肽，第1位的甲硫氨酸可以被胰凝乳蛋白酶水解和溴化氰试剂去掉。这51个氨基酸冶好对应于庸鲽抗菌肽hipposin，经过克隆

6、验证将其命名为Ca—L．hipposin抗菌肽。青鱼、草鱼、鲢、鳙在该位点也可被相应的蛋白酶切割产生类hipposin抗菌肽。说明淇河鲫、青鱼、草鱼、鲢和鳙组蛋白H2AN．端可衍生类hipposin抗菌肽。克隆获得淇河鲫组蛋白H2A开放阅读框ORF序列387bp，共编码128个氨基酸，3'-UTR非编码长度为466bp，具有AATAAA的多聚腺苷酸终止信号位点，5'-UTR非编码长度为55bp，全长共908bp。淇河鲫组蛋白H2A属于阳离子0【螺旋抗菌肽，其空间结构同大西洋鲑(Salmosalar)、虹鳟鱼(Oneorhynchusmykiss)、斑马鱼的组蛋白H2A

7、空间结构相似性达到96％。为组蛋白H2A基因及衍生类hipposin抗菌肽基因深入研究提供了分子基础。采用实时荧光定量RT．PCR技术，检测淇河鲫在以下八个组织：肝脏、肾脏、脑、脾脏、鳃、心脏、肌肉、肠中mRNA表达水平，结果显示在淇河鲫8个组织当中，组蛋白H2AmRNA表达在肾脏表达量最高，脾脏次之，其次为鳃、脑、肝脏，其中表达量较少为肠道和心脏，肌肉中表达量最少。采用实时荧光定量RT．PCR技术，采用2。△△吐方法分析淇河鲫腹腔注射嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)诱导表达组蛋白H2A和Ca-L—hipposin抗菌肽变化。嗜