两株弧菌的分子鉴定【开题报告+文献综述+毕业设计】

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本科毕业论文系列开题报告生物技术两株弧菌的分子鉴定一、选题的背景与意义弧菌在自然环境中分布广泛，生境多样。从淡水到混水，再到海水，尤其是有机质丰富的海淡水汇合的港湾。温度、盐度、有机营养等受潮汐、暴雨的影响波动很大，对弧菌的冲击也很大。同时弧菌既能游离生活，又能与其他生物附生或共生，有些还是人类和/或养殖动物的条件致病菌。弧菌的水生生态学研究表明，水生环境对弧菌的时空分布及相关疾病的爆发都起着非常重要的作用。核糖体是细菌唯一的细胞器，其16SrRNA在进化中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，常用于细菌的鉴定与分类研究。1977年，C.Weose等在分析原核生物16SrRNA和真核生物18SrRNA序列的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之间的系统发育关系，为弧菌分类与鉴定提供了理论和实践基础。16SrRNA基因序列包含10个可变区(variableregion)和11个恒定区(constantregion)，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关。在生物进化的漫长过程中，其基因序列的变化非常缓慢，因此可以用来标记生物的进化距离和亲缘关系。迄今为止已有许多弧菌的的全序列16SrRNA基因得以破译并免费公布，十分方便进行类似序列的比较分析。随着研究的深入，逐渐建立了以16SrRNA基因为分类标准的各大数据库例如：GeneBenk、EMBL等。这些数据库为广大的分类及分子研究的科研院所以及学者提供了强大的数据支持。本研究采用一对弧菌16SrRNA基因引物通用PCR扩增两株未知弧菌的部分16SrRNA基因，对基因扩增片段做进一步的序列测定，通过序列同源性分析显示，从而确定该弧菌的分类学地位。该方法是一种十分方便有效的弧菌鉴定方法，可在实践中加以推广应用。通过此项课题为进一步探究16SrRNA基因在弧菌鉴定上发挥的作用和寻找防治致病弧菌的新方法提供理论依据。同时为研究弧菌群落演替提供技术支撑，为揭示弧菌的生态学和流行病学规律具有重要意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容： 本实验主要是对采样获取的两株弧菌中提取其总DNA，获得该两株菌的16SrRNA基因，并进行分子鉴定与序列分析及进化树构建。拟解决的问题：16SrRNA基因与其他高分辨基因(如recA基因等)相结合进行对弧菌进行鉴定和系统发育树分析。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1.实验材料本实验材料为从环境样品中提取出的两株弧菌，进分离纯化后接种到培养皿培养备用。2.形态学特征和生理生化鉴定菌落大小、表面形态、边缘、质地和光泽等特征进行初步鉴定。3.总DNA提取1、大试管液体扩繁，收集10ml培养液，离心；2、加入2mlTE悬浮菌体，溶菌酶100ul（50mg/ml）、RnaseA10ul(10mg/ml)，摇匀；水浴30min3、加入120ul10%SDS和蛋白酶K(20mg/ml)10ul60℃水浴30min—1h4、加入500ul5mol/LNaCl，320ulCTAB/NaCl，65℃水浴10min5、3ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次（一定要混匀）6、转移上清后用等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提1次7、加入1/10体积的(3mol/L)NaAC，0.6体积异丙醇沉淀DNA8、用70%的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质。9、所得的沉淀DNA用50ul水溶解，加入50ul的5mol/l的NaCl溶液，充分混匀。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀后重新70%酒精洗涤。风干后，用25ul水溶解样品。10、风干后，用50ul水溶解样品，-20℃保藏。4PCR方法测定获取目的基因序列16SrRNA基因PCR扩增设计两个引物。在20tA反应体系中含有：无菌蒸馏水14.4μL，1×PCR缓冲液2μL，1.5mmol/LMgCl21.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物各0.2μL，2.5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL，模板DNA1μL。PCR反应条件为：95℃预变性3min、接94℃变性lmin、55℃复性1min和72℃延伸2min，30个循环后72℃温育6min。 5.随机测序及序列分析琼脂糖凝胶检测PCR产物，预期大小的扩增条带回收后克隆至pMD19-T载体，对序列进行序列测定。序列测定和分析采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定。序列分析采用BLASTP分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，多重序列比对采用DDBJ软件ClustalW程序(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)，等电点分析采用ExPASy软件(http://www.expasy.ch/)，系统进化分析由MEGA4.0版程序完成(Tamuraetal，2007)。6菌种分类位置确定根据细菌形态、培养基理化特性测定的结果，依据相关资料，并结合细菌发育学分析的结果，进行分离菌的种属分类位置判定（二）技术路线环境样品 弧菌分离纯化菌株形态特征确定这两株菌的分类学地位菌株生长曲线测定弧菌总DNA的提取序列分析多重序列比对系统进化分析随机测序与序列分析16SrDNA序列的PCR扩增四、研究的总体安排与进度2010.9-2010.10毕业论文选题2010.10-2010.11进行文献查阅和资料收集，.完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。2010.11-2011.1获得弧菌的16SrRNA基因，对其进行BLAST分析，比对分析和16SrRNA基因进化树构建，确定其分类学地位。2011.1-2011.2数据和材料整理、分析。2011.2-2011.3开题答辩与综述。2011.3-2011.5完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献：[1]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京科学出版社.2001:106-128. [2]CristianeCThompson,AnaCarolinaPVicente,RangelCSouza.Genomictaxonomyofvibrios[J].BMCEvolutionaryBiology.2009,9(258):2131-2148.[3]WoeseCR,FoxGE.Phylogeneticstructureoftheprokaryoticdomain.Theprimarykingdoms[J].ProcNatlAcadSciUSA1977,74(11):5088-5090.[4]Williams,Willkins,Baltimore.Bergey＇sManualofSystemaicBacteriology[M].1986:284-296.[5]ThompsonFL,KloseKE.VibriotheFirstInternationalConferenceontheBiologyofVibrios[J].Bacteriol2005,188(13):4592-4596.[6]WoeseCR.Bacterialevolution[J].MicrobiolRev.l987,5(1):221-271.[7]DubnauD,SmithI,MorellP,etal.GeneconservationinBacillusspecies.Conservedgeneticandnucleicacidbasesequencehomologies[J].PmcNailAcadSciUSA.1965,54(2):491-498.[8]HuntDE,DavidLA,GeversD.Resourcepartitioningandsympatricdifferentiationamongcloselyrelatedbacterioplankton[J].Science2008,320(58):1081-1085.[9]YamamotoS,HarayamaS.PCRamplificationanddirectsequencingofgyrBgeneswithuniversalprimersandtheirapplicationtothedetectionandtaxonomicanalysisofPseudomonasputdastrains[J].ApplEnvironMicrobiol.1995,61(3):1104-1109.[10]杨鸢劫,俞菊华,陈辉等.暗纹东方鲢非O1群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测[J].水产学报.2006,30(4):525-530.[11]BioscaEG,OliverJD,AmaroC.PhenotypiccharacterizationofVibriovulnificusbiotype2,alippolysaccharide-basedhomogeneousOserigraphwithinVibriovulnificus[J].ApplEnviMicrobiol.1996,66(3):918-927.[12]FouzB,AmaroC.IsolationofanewserovarofVibriovulnificuspathogenicforeelsculturedinfreshwaterfarms[J].Aquaculture.2003,21(7):677-682.[13]韩先朴,卢全章.鳗鲡弧菌病病原的分离与鉴定[J].微生物学报.1984,24(4):386-391.[14]林天龙,许斌福,董传甫等.鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定[J].中国人兽共患病杂志.2005,21(11):995-997.[15]王国良,金珊,薛良义等.海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究[J].黄渤海海洋.2000,18(3):85-89.[16]郭明元,刘广锋,冯娟.1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析[J].中国水产科学.2006,13(5):823-828.[17]朱传华,何建国,黄志坚.网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究[J].中山大学学报.2000,39(3):278-282. [18]ThompsonC,ThompsonK,VandemeulebroeckeK,etal.UseofrecAasanalternativephylogeneticmarkerinthefamilyVibrionaceae[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology.2004,54(5),919-924.[19]塞文婴,东秀珠.定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用[J].微生物学通报.2000,27(5):377-381.[20]谢珍玉,胡超群.弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展[J].热带海洋学报.2005,24(3):86-95.[21]LinkousDA,OliverJD.PathogenisisofVibriovulnifwua(MiniReview)[J].FEMsMicrobiolLetters.1999,174(16):207-213.[22]於剑,艾必燕,樵星芳等.16SrRNA的高级结构分析在细菌分类鉴定上的应用[J].重庆中草药研究.2010,6(1):29-32.[23]李献梅,王小芬,杨洪岩等.促旋酶B亚单位基因gyrB在鉴别细菌近缘种中的应用[J].微生物学报.48(5):701-706.[24]邴旭文,阎斌伦,张晓君等.泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定[J].海洋与湖沼.2009,40(6):692-698. 毕业论文文献综述生物技术弧菌的分子鉴定研究相关进展摘要：弧菌分布广泛，与人类生活关系密切。由于传统的弧菌分类鉴定中仍有诸多不足，如在弧菌及近似菌鉴定和某些相近弧菌种属细致分类等方面，近年来弧菌的种类也增加迅速，传统的分类鉴定局限性越来越明显。随着分子生物学技术的应用，弧菌的分子鉴定与系统发育学分析的意义日益彰显。本文主要介绍关于弧菌的分子鉴定以及系统发育分析的最新研究进展。关键词：16SrRNA基因弧菌分子鉴定系统发育学分析前言弧菌是一大群菌体短小，弯曲成弧形的革兰阴性菌，弧菌与肠杆菌科的主要不同点是氧化酶试验阳性（麦契尼可夫弧菌除外）和有一根位于菌体一端的单鞭毛[1]。弧菌中主要致病菌有溶藻弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌和霍乱弧菌等。1弧菌传统分类概述1.1弧菌分类学简述17世纪80年代，列文虎克首次观察到微生物标志着微生物形态学发展阶段的起始点，但是直至19世纪60年代初，关于弧菌类进行的观察和记载，仍然停留在形态学的简单分类上。19世纪60年代初，巴斯德（LouisPasteur）、柯赫（RobertKoch）等一批杰出的科学家建立了一套独特的微生物研究方法，成为微生物生理学分类的标志。在这个时期，炭疽病、霍乱和狂犬病等传染病的致病病因等重大发现，以及固体培养基的改进，划线法的纯种分离，建立了细菌细胞的染色技术，显微摄影技术和悬滴培养法，为弧菌的生理学分类提供了重要的生物技术基础。这时的弧菌分类学主要以弧菌的生理生化特征为基础而进行分类学研究。20世纪50年代初，随着电镜技术和其他高技术的出现，对弧菌的研究进入到分子生物学的水平。1953年J.D.Watson和F.H.Crick发现了细菌基因体脱氧核糖核酸长链的双螺旋模型。1961年F.Jacab和J.Monod提出了操纵子学说，指出了基因表达的调节机制和其局部变化与基因突变之间的关系，即阐明了遗传信息的传递与表达的关系[2]。1977年，C.Weose等在分析原核生物16SrRNA和真核生物18SrRNA序列的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之间的系统发育关系[3]，这标志着弧菌分类进入到分子水平阶段。 1.2弧菌的形态学分类传统形态分类学主要在菌落的形态特征，菌体的显微结构，如形状，弧度的大小，鞭毛的分布以及数量，荚膜的有无以及荚膜的形态特征以及弧菌的运动性等方面来对弧菌进行分类。弧菌科包括弧菌属、气单胞菌属与邻单胞菌属。多年来，许多学者致力于致病性弧菌的研究。《伯杰氏系统细菌学手册》(1984，九版)[4]自问世以来，有许多过去没能认定的致病性弧菌有所证实及归属。这在弧菌分类学历史上有非常重要的意义。1.3弧菌的生理生化特征分类目前根据生理生化特征鉴定弧菌的鉴定系统有API2ID32E系统、V-18系统、Biolog2GN系统等。弧菌可以根据接触酶试验、氧化酶试验、葡萄糖发酵、氨基酸依赖性、硝酸盐还原、药敏试验以及耐盐性检查等生理生化特征进行鉴定以及分类[5]。1.4弧菌的分类变化贝内克菌属与射光杆菌名称现已废止，将它们移入弧菌属，而发光杆菌属仍然保留。弧菌属中的鳗鱼弧菌和美人鱼弧菌移入了李斯特氏菌属，1986年获得公认。但不久美人鱼李斯特氏菌又移入发光杆菌属中。气单胞菌属的分类研究很不充分，对鲑致病的气单胞菌与其它单胞菌不同，无动力，在5℃生长，37℃不生长，能发酵葡萄糖产生少量气体，因此曾提出归入坏死气单胞菌属，但提案现未能通过，至今仍称为杀鲑气单胞菌。有人重新将气单胞菌从弧菌科分开，另设气单胞菌科。在该菌科中，包括弧菌属，发光杆菌属，也包括李斯特氏菌属及第瓦氏菌属。后者无致病性，一部分菌种以前包括在丛胞菌属中。216SrRNA基因在分子鉴定中的应用2.116SrRNA基因的研究传统细菌鉴定方法程序繁琐，时间长，费用高；同时对菌属中各菌种生理生化特性要有详细的认识；并且对鉴定工作者的要求也非常高。虽然酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)等免疫血清学方法大大提高了检测效率，但这些鉴定方法的抗原制备操作繁琐，检测周期至少也需要2天时间，仍无法满足快速鉴定各种弧菌的要求[6-7]。有学者通过对500多种不同生物的rRNA基因序列的分析发现其一级结构非常保守，某些序列甚至完全一致[8]。16SrRNA基因的可变区和恒定区互相交错排列，可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守[9]。由于16SrRNA基因的功能同源性高且古老，分子大小便于研究，其演化速率和进化距离相对应，既含保守又有可变序列等，因此已是细菌分类学中最常用、最有用的分子鉴定基因。通过分析16SrRNA基因序列，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近，如DNA杂交同源性在60％一70％以上，或细菌间16SrRNA序列同源性达 97％以上的菌株就可定为一个种，如同源性只有95％，则判定为属于不同属[10]。Woese等在通过对16SrRNA基因研究的基础上，已经构建了现已被世界公认的整个生物三域的系统发育进化树。2.216SrRNA基因的研究特点16SrRNA基因序列有10个可变区(variableregion)和11个恒定区(constantregion)，可变区因细菌而异，变异程度与细菌的系统发育密切相关[11]。大量研究试验证明，总体来说，16SrRNA基因比较适合用于揭示各种生物物种间的种属亲缘程度。久远的演化历程中，16SrRNA基因进化速率非常缓慢，因此16SrRNA基因适合用于作为生物进化距离及其种属亲缘程度的分子标记。目前想获得16SrRNA基因的精确突变速率仍还有很多问题尚待解决，如相异的种群进化速率不同，相同的种群进化速率也不一定相同，且其基因中含有高速率突变的“热点”区以及高度保守区[9]。但鉴于16SrRNA基因的功能同源性高且古老，分子大小便于研究，其演化速率和进化距离相对应，既含保守又有可变序列等，因此已是细菌分类学中最常用、最有用的分子鉴定基因。16SrRNA基因由大约1550个核苷酸组成，其长度既能够表现足够的种间多态性，又便于序列分析。除16SrRNA基因外，科学家也试图用其他核糖体rRNA基因如16～23SrRNA基因区间以及很多蛋白质进行分析鉴定。但是经过大量相关实验后表明，尽管在个别种类细菌的鉴定上，那些基因相对来说有更好的分辨率[13]，但一般而言，16SrRNA基因更适用于判定不同类别细菌的分类学地位。2.316SrRNA基因序列分析方法16SrRNA基因序列分析中，首先提取菌体的总DNA，利用PCR方法扩增获取样所得总DNA中的16SrRNA基因片段，再通过测序等方法获得该序列信息，然后与16SrRNA基因序列数据库中的数据进行比对，确定该样本在进化树中的位置，从而确定该菌的分类学地位，即其所属的科属种等。获得测序结果之后，一般会对其进行系统发育分析，即构建系统发育树。构建进化树的计算方法有最小进化方法，最大似然法，最大节约法，距离建树法和相邻连接方法等。常用的序列比对软件有BLAST、ClutalW(或ClutalX1.83版本)、MEGA、DNAman等，也有些在线序列比对网站点可以进行在线比对，服务器是常开的。当然，由于这些序列分析软件所使用的程序方法不同，结果也许各有差异。2.416SrRNA基因在弧菌序列分析中的应用16SrRNA 基因序列分析检测最大的优势是检测速度快，常规的细菌鉴定和培养方法无法望其项背。而且有些用表型以及生理生化特征难以鉴定的弧菌，16SrRNA基因生物信息学分析可以对其分类地位给出准确的鉴定。2.4.1鉴别难以区分的弧菌16SrRNA基因序列分析鉴定一般能够精确到种的水平，因此可以用来鉴定用其他方法难于区分的弧菌。例如，有些相似弧菌之间致病力差异较大，但普通的形态学检测和生理生化指标测定对其难以区分，这给临床上的应用和水产品养殖病害的预防和诊治带来了诸多不便。因此应用16SrRNA基因可以快速鉴定表型上难以区分的弧菌，哈氏弧菌与创伤弧菌之间，以及鳗弧菌与双氮弧菌等通过表型难以区分，均可以通过16SrRNA基因来对弧菌进行鉴定和区别[14]。由于16SrRNA基因序列分析是在进化基础上对弧菌进行分类，比通过表型分析方法分类更能确定弧菌之间的亲缘关系，因此可以纠正过去分类学上的一些错误认识。2.4.2鉴别临床或水产品养殖感染的弧菌弧菌与人类生活密切相关，许多弧菌与人类肠道感染性疾病以及水产品养殖感染性疾病等相关。据相关研究表明，已知的致病弧菌有70多种，哈维氏弧菌(V．harvey)、副溶血弧菌(V．parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V．alginolyticus)、鲨鱼弧菌(V．carchariae)、霍乱弧菌（V.cholerae）、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、鳗弧菌(V．anguillarum)和最小弧菌(V．mimicus)等是主要的致病弧菌[15]。郭明元等[16]在军曹鱼体内分离出一株弧菌，通过测定其16SrDNA序列，构建了系统发育树，分析了相关弧菌的同源性，从而确定该致病弧菌为鲨鱼弧菌。2.4.3鉴定微生物环境中多种弧菌的群落演替通过对16SrRNA基因分析环境中弧菌群落组成的变化，可以发现其群落演替的规律和外界条件的改变对群落演替的影响等。利用16SrRNA基因分析，不仅速度快，且其精度更高,适于分析大量弧菌的种群变化规律研究[1718]。3弧菌基因的分子鉴定与系统进化分析3.116SrRNA基因的局限但利用16SrRNA基因鉴定其生物学地位也有其局限性，基因横向水平转移及进化速度不同，从单一基因来推断整个生物界的系统进化，其鉴定结果容易出现偏差。对于某些弧菌的16SrRNA基因系统进化分析，16SrRNA基因的分辨率有所不足[1920]。鉴于以上原因，因此近年来弧菌分子鉴定和系统进化在应用其他的基因与16SrRNA基因相结合从而共同鉴定的方向发展[21]。同时，关于16SrRNA高级结构分析在细菌分类上的鉴定的应用也取得了重大进展。 3.216SrRNA高级结构应用于分类鉴定20世纪80年代以来，一些学者开始转向了对16SrRNA二级结构的分析研究，并且已经取得了不小的进展。相关研究表明，16SrRNA二级结构可做为一个新分类指标，并作为系统分类的重要补充。相比一级结构而言，二级结构在系统分类中有着更独特的意义。首先，16SrRNA的二级结构具有更高的保守性，尽管不同的rRNA的一级结构可能有所不同，但他们都可折叠成类似的二级结构即由多个臂环(stem—loopstructure)所组成的结构。1983年，Woese等比较分析了细菌界、古细菌界和真核生物界共150多个物种的16SrRNA基因全序列，详细论述了三界生物16SrRNA二级结构的特点，发现序列比较方法不但是预测假定结构的一个有力工具，而且有利于发现该分子的重要功能区段，同时指出二级结构上的改变可能导致能量变化并影响到功能[22]。3.3gyrB基因在弧菌分类学鉴定上的应用gyrB基因是编码促旋酶B亚单位的基因，普遍存在于细菌中。该基因进化速率较快,每100万年的平均碱基替换率为0.7%～0.8%。相关学者提出,gyrB基因能对假单胞菌、弧菌、气单胞菌等不同属内的近缘种进行分子鉴定,还可通过设计种特异性引物进行定量PCR,同时也能结合变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)追踪微生物的动态。gyrB基因弥补了16SrRNA基因或ITS序列无法区分近缘种的缺陷,给近缘种的鉴别或其群体指纹图谱分析带来了新的曙光,是当前国内外用于近缘种研究的热点,是细菌系统发育分析上非常值得重视的新的分子鉴定基因之一。邴旭文等综合比较了gyrB基因与16SrRNA基因对霍乱弧菌的分辨率，实验证明，gyrB基因比16SrRNA基因在霍乱弧菌的鉴定上具有更高的分辨率[2324]。因此，在16SrRNA基因基础上，通过其与gyrB基因相结合将会在分辨率以及高精度高通量等各方面上都有更优化的鉴定效果。3.4recA基因在弧菌分类鉴定上的应用RecA蛋白具水解蛋白酶活性，RecA蛋白除参与DNA重组之外，还参与DNA修复、突变和细胞分裂，为多功能蛋白。在许多弧菌中均存在功能类似的RecA蛋白[25]。有研究发现，RecA基因对霍乱毒素基因在霍乱弧菌染色体上的拷贝扩增起作用，使菌株的毒力增强。Mahenthiralingam等发现利用recA基因研究Burkholderia属所有细菌的分类，证明是RecA基因是非常有效的鉴定工具。Thompson等[26]利用recA做标记研究弧菌科细菌的系统发育关系，表明recA基因比l6SrRNA具有更好的辨别能力，适合做为弧菌科细菌鉴定的工具。王成义等[27]通过实验发现，虽然霍乱弧菌Vibriocholerae与拟态弧菌Vibriomimicus亲缘关系较近，但是比较两株进化树可知它们的发育学地位并不完全一致，根据16SrRNA 基因建树结果两种不同的细菌混杂在一起，而依据recA基因建树的结果能够把两种不同的细菌分开，霍乱弧菌与拟态弧菌的16SrRNA基因和recA基因的序列同源性分别为99．4％～99．6％、92-3％～93．1％。4展望弧菌的分类和鉴定经历了漫长的研究阶段。随着分子生物学的发展，以细菌的形态学、生理生化等为特征的鉴定细菌方法逐渐被一种以可翻译核苷酸序列为基础的可定量、较精确的分析方法所取代。1977年，C.Weose等在分析原核生物16SrRNA和真核生物18SrRNA序列的基础上，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之间的系统发育关系，这标志着弧菌分类进入到分子水平阶段。随着弧菌发现的种类的增加，以及分类学中新的问题的出现，新的分子鉴定基因不断出现，具有较高分辨率的分子基因如recA基因、gyrB基因、dnaE基因、mdh基因和gapA基因等多种基因与16SrRNA基因相结合，共同分析鉴定，从而将其精确定位。相信随着科学技术的发展，分子鉴定系统将会越来越完善，分子鉴定的精度也会越来越高，而且随着人们对基因的进一步深化了解和实验技术的发展，那些通过分子鉴定也难以准确定位的物种终将准确定位。分子鉴定将会朝着系统化和高精度化发展。参考文献[1]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京科学出版社.2001:106-128.[2]CristianeCThompson,AnaCarolinaPVicente,RangelCSouza.Genomictaxonomyofvibrios[J].BMCEvolutionaryBiology.2009,9(258):2131-2148.[3]WoeseCR,FoxGE.Phylogeneticstructureoftheprokaryoticdomain.Theprimarykingdoms[J].ProcNatlAcadSciUSA1977,74(11):5088-5090.[4]Williams,Willkins,Baltimore.Bergey＇sManualofSystemaicBacteriology[M].1986:284-296.[5]ThompsonFL,KloseKE.VibriotheFirstInternationalConferenceontheBiologyofVibrios[J].Bacteriol2005,188(13):4592-4596.[6]WoeseCR.Bacterialevolution[J].MicrobiolRev.l987,5(1):221-271.[7]DubnauD,SmithI,MorellP,etal.GeneconservationinBacillusspecies.Conservedgeneticandnucleicacidbasesequencehomologies[J].PmcNailAcadSciUSA.1965,54(2):491-498.[8]HuntDE,DavidLA,GeversD.Resourcepartitioningandsympatricdifferentiationamongcloselyrelatedbacterioplankton[J].Science2008,320(58):1081-1085.[9]YamamotoS,HarayamaS.PCRamplificationanddirectsequencingofgyrBgeneswithuniversalprimersand theirapplicationtothedetectionandtaxonomicanalysisofPseudomonasputdastrains[J].ApplEnvironMicrobiol.1995,61(3):1104-1109.[10]杨鸢劫,俞菊华,陈辉等.暗纹东方鲢非O1群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测[J].水产学报.2006,30(4):525-530.[11]BioscaEG,OliverJD,AmaroC.PhenotypiccharacterizationofVibriovulnificusbiotype2,alippolysaccharide-basedhomogeneousOserigraphwithinVibriovulnificus[J].ApplEnviMicrobiol.1996,66(3):918-927.[12]FouzB,AmaroC.IsolationofanewserovarofVibriovulnificuspathogenicforeelsculturedinfreshwaterfarms[J].Aquaculture.2003,21(7):677-682.[13]韩先朴,卢全章.鳗鲡弧菌病病原的分离与鉴定[J].微生物学报.1984,24(4):386-391.[14]林天龙,许斌福,董传甫等.鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定[J].中国人兽共患病杂志.2005,21(11):995-997.[15]王国良,金珊,薛良义等.海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究[J].黄渤海海洋.2000,18(3):85-89.[16]郭明元,刘广锋,冯娟.1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析[J].中国水产科学.2006,13(5):823-828.[17]朱传华,何建国,黄志坚.网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究[J].中山大学学报.2000,39(3):278-282.[18]ThompsonC,ThompsonK,VandemeulebroeckeK,etal.UseofrecAasanalternativephylogeneticmarkerinthefamilyVibrionaceae[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology.2004,54(5),919-924.[19]塞文婴,东秀珠.定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用[J].微生物学通报.2000,27(5):377-381.[20]谢珍玉,胡超群.弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展[J].热带海洋学报.2005,24(3):86-95.[21]LinkousDA,OliverJD.PathogenisisofVibriovulnifwua(MiniReview)[J].FEMsMicrobiolLetters.1999,174(16):207-213.[22]於剑,艾必燕,樵星芳等.16SrRNA的高级结构分析在细菌分类鉴定上的应用[J].重庆中草药研究.2010,6(1):29-32.[23]李献梅,王小芬,杨洪岩等.促旋酶B亚单位基因gyrB在鉴别细菌近缘种中的应用[J].微生物学报.48(5):701-706.[24]邴旭文,阎斌伦,张晓君等.泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定[J].海洋与湖沼.2009,40(6):692-698. [25]张晓君,陈翠珍,阎斌伦等.凡纳滨对虾病原副溶血弧菌的表型及分子特征[J].海洋与湖沼.2009,40(5):654-662.[26]ThompsonFL,KloseKE.VibriotheFirstInternationalConferenceontheBiologyofVibrios[J].Bacteriol.2005,188(13):4592-4596.[27]王成义,闰茂仓,陈少波等.基于16SrRNA和recA香鱼鳗利斯顿氏菌的分离鉴定[J].海洋通报.2010,29(1):84-91. 本科毕业设计（20__届）两株弧菌的分子鉴定 目录摘要（Abstract）1引言……………………………………………………………………………………………………………..11.1弧菌分类学现状与分类学历史………………………………………………………………………..11.1.1弧菌分类学现状……………………………………………………………………..……………..11.1.2弧菌分类学历史…………………………………………………………………………………...11.216SrRNA简介与应用……………………………………………………………………………………11.3研究的意义与内容………………………………………………………………………………………22材料与方法……………………………………………………………………………………………………..22.1实验材料、仪器和试剂…………………………………………………………………....……………..22.1.1材料…………………………………………………………………………………………………..22.1.2仪器与设备…………………………………………………………………………………………22.1.3试剂………………………………………………………………………………………………...32.2方法与步骤………………………………………………………………………………………………..32.2.1实验材料准备及形态学观察………………………………………………………..........................32.2.2改良弧菌DNA提取方法……………………………………………………………………………...32.2.3DNA测定………………………………………………………………………………………………42.2.4PCR扩增与测序…………………………………………………………………………………….42.2.5生物信息学分析……………………………………………………………………………………...53结果与分析……………………………………………………………………………………..........................53.1两株弧菌的分离及形态学观察…………………………………………………………………………...53.2两株弧菌的DNA提取及其测定……………………………………………………..…………………..63.316SrRNA基因的PCR扩增与测序…………………………………………………………………………73.416SrRNA基因序列分析………………………………………………………………...............................83.5系统发育分析…………………………………………………………………………...............................84.讨论…………………………………………………………………………………………….……………….94.1形态学观察…………………………………………………………………………………………………94.2改良弧菌DNA提取方法………………………………………………………………………………..104.3弧菌分子鉴定结果……………………………………………………………………….........................105结论…………………………………………………………………………………………….……………...10参考文献…………………………………………………………………………………………………………12 附录………………………………………………………………………………………………………………13附录一：XHS2-9号菌株的16SrRNA基因测序结果………………………………………………………13附录二：461号菌株的16SrRNA基因测序结果…………………………………………………………….13 摘要：本文选用的环境样品为朱家尖浅水区水样，利用TCBS培养基培养梯度稀释平板法分离纯化出相应的两株未知优势弧菌。本文建立了一种基于CTAB-NaCl法的改良弧菌DNA提取的方法，该法通过高盐和CTAB对黏性多糖的沉淀而除去多糖，从而从富含黏性多糖的弧菌中提取获得了高质量的DNA。以16SrRNA基因作为分子标记对环境样品中分离的两株未知弧菌样品进行系统发育学分析从而对其分类学地位进行鉴定，鉴定结果为461号菌株为弧菌属（Vibrio）的溶藻弧菌(V．alginolyticus)，而XHS2-9号菌株为弧菌属（Vibrio）的哈维氏弧菌(V．harveyi)。关键词：弧菌；16SrRNA；分子鉴定；系统发育学分析Abstract:ThisessayselectedforenvironmentalsamplesfromzhujiajianphytalzoneandutilizedtheTCBSculturemediumtoculture,separateandpurifythecorrespondingdominatevibriosbythemethodofserialdilutionofwatersamples.Aftertheacquisitionofthecorrespondingtwostrainsofvibiros,WeestablishedaimprovedDNAextractionmethodbasedontheCTAB–Naclofthevibrios.Andthismethodutilizedthehigh-saltandCTABtoremovethepolysaccharidebyprecipitatingtheviscouspolysaccharide，inthismethodweacquiredhigh-qualityDNAfromthepolysaccharide-richvibrios.Wemadephylogeneticanalysesaboutthetwostrainsofseparatedunknownvibriosfromenvironmentalwatersamplesandidentifiedtheirtaxonomicalstatusbythemeansof16SrRNAgeneasamolecularmarker.Theidentificationresultshowedthatthe461strainistheV．alginolyticusoftheVibrioandtheXHS2-9strainistheV．harveyioftheVibrio。Keywords:vibrios；16SrRNA；molecularidentification；phylogeneticanalyses1引言1.1弧菌分类学现状与分类学历史1.1.1弧菌简介及分类学现状弧菌分布广泛，与人类生活密切相关[1]。传统形态分类学主要在菌落的形态特征和生理生化特征如菌体的显微结构形状，弧度大小，鞭毛数量与分布，荚膜有无与荚膜的形态特征以及弧菌运动性等方面和如革兰氏染色，发酵葡萄糖反应，氧化酶反应等相应的生理生化特征来对弧菌进行分类。多年来，许多学者致力于弧菌分类学的研究，《伯杰氏系统细菌学手册》(1984，九版)[3]自问世以来，有许多过去未能认定的致病性弧菌有所证实及归属，这在弧菌分类史上是一个非常重要的里程牌。在众多的弧菌之中，不同种的致病性差异很大，而随着当今发现的弧菌种类日益增加，弧菌分类学在致病性差异上的研究日趋重要。如O1型霍乱弧菌被WHO定为国际检疫菌，但许多与O1相似菌株却并不具备致病性[2]。但是目前弧菌分类学系统仍有诸多不足，而且随着日益增加的弧菌种类和近似菌种的细致区分以及由于菌种之间致病因子的横向基因转移等导致传统的分类鉴定的局限性日益明显。1.1.2弧菌分类学历史17世纪80年代，列文虎克首次用自制显微镜观察到微生物这标志着微生物形态学发展阶段的起始点。但直至19世纪60年代初，关于弧菌分类学所进行的观察和记载，仍只停留在形态学基础分类上[4]。1915 世纪60年代初，巴斯德（LouisPasteur）、柯赫（RobertKoch）等一大批杰出科学家建立了一套独特的微生物研究方法，成为微生物生理生化分类学的标志[5]。在这个时期，霍乱和狂犬病等传染病的致病病因等重大发现，以及固体培养基的改进，划线法的纯种分离，建立了细菌细胞的染色技术，显微摄影技术和悬滴培养法，为弧菌的生理学分类提供了重要的生物技术基础。这时的弧菌分类学主要以弧菌的生理生化特征为基础而进行分类学相关研究。20世纪50年代初，随着分子生物学的兴起以及日益增加的高新技术出现，对弧菌的研究进入到分子生物学的水平。1977年，C.Weose等经过分析原核生物16SrRNA基因序列和真核生物18SrRNA基因序列后，提出了可将自然界生物分为细菌、古菌和真核生物三域，揭示了各生物之间的系统发育关系[6,7]，这标志着弧菌分类进入到分子水平阶段。1.216SrRNA简介与应用16SrRNA基因有11个恒定区(constantregion)和10个可变区(variableregion)，恒定区相对保守，而可变区因细菌而异，其变异程度与细菌的系统发育密切相关[8]。16SrRNA基因由大约1550个核苷酸组成，其长度既能够表现足够的种间多态性，又便于序列分析。大量研究试验证明，总体来说，16SrRNA基因比较适合用于揭示各种生物物种间的种属亲缘程度。历时久远的演化历程中，16SrRNA基因进化速率非常缓慢，因此16SrRNA基因适合用于作为生物进化距离及其种属亲缘程度的分子标记。目前想获得16SrRNA基因的精确突变速率仍还有很多问题尚待解决，相异的种群进化速率不同，相同的种群进化速率也不一定相同，且其基因中含有高速率突变的“热点”区以及高度保守区[9]。但鉴于16SrRNA基因的功能同源性高且古老，分子大小便于研究，其演化速率和进化距离相对应，既含保守又有可变序列等，因此已是细菌分类学中最常用、最有用的分子鉴定基因。通过分析16SrRNA基因序列，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近，如DNA杂交同源性在60％一70％以上，或细菌间16SrRNA序列同源性达97％以上的菌株就可定为一个种，如同源性只有95％，则判定为属于不同属[10]。16SrRNA基因序列分析检测的优势是速度快，高通量，高精确性等，常规的细菌鉴定系统和生理生化特征等无法望其项背[11]。另外，一部分难以根据表型来鉴定的弧菌，可用16SrRNA基因序列分析能判定其准确的分类学地位。1.3研究的意义与内容虽然有些弧菌致病力之间差异较大，但基础形态学检测和生理生化指标较难区分这些弧菌，这给临床上的应用和水产品养殖病害的预防和诊治带来了诸多不便。通过应用16SrRNA基因可以快速鉴定在表型上难以区分的弧菌。哈氏弧菌与创伤弧菌之间，以及双氮弧菌与鳗弧菌等通过表型难以区分，通过16SrRNA基因来对弧菌进行鉴定和区别已经有学者对此作出研究[12-14]。本研究主要通过弧菌群落特征对所分离纯化得到的弧菌进行初步鉴定，然后通过弧菌总DNA的提取及16SrRNA基因的扩增获取，经测序后运用生物信息学的相关知识利用相关软件进行系统发育树的构建从而确定这两株未知弧菌的分类学地位。另本研究针对传统法提取弧菌总DNA的不足做出改进，拟得出最佳改良弧菌总DNA提取方法。本研究目标是获取最佳改良弧菌总DNA提取方法，以及通过16SrRNA基因获取及分析，对环境样品中所采取的两株未知菌进行分子鉴定从而确定这两株弧菌的种属等分类学地位。本研究基于弧菌16SrRNA基因特性，应用PCR技术研究环境样品中两株优势弧菌的种属地位，旨在为大规模研究菌落生态演替和生长环境变化打下理论和工具基础，同时为水产品养殖病害的预防和诊治提供理论支持和技术支撑。15 2材料与方法2.1实验材料、仪器和试剂2.1.1材料本实验选用的环境样品为于2009年8月采集的朱家尖浅水区水样。通过利用TCBS培养基培养，梯度稀释平板法分离纯化出相应的两株菌。已分离的菌株斜面在4℃冰箱中保存，以备使用。实验前对相应菌株用LB液体培养基进行扩繁培养12h左右。2.1.2仪器与设备1.BIO—RAD梯度PCR仪（PTC0100）江苏省科学器材有限公司2.Eppendorf微量移液器上海艾研生物科技有限公司3.Eppendorfcentrifuge冷冻离心机（5415R）上海肯强贸易有限公司4.Eppendorfcentrifuge冷冻离心机（5415D）上海齐羿电子科技有限公司5.电泳仪（BG—Power600i）上海精宏实验设备有限公司6.电子天平（AL104）梅特勒—托利多仪器有限公司7.台式高速冷冻离心机（TGL—16M）长沙湘仪离心机仪器有限公司8.REVCD1386-3V型超低温冰箱美国REVCD公司9.Galanz微波炉（PTO23TP—KT）佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司10.电热恒温水槽(DK—8D型)上海精宏实验设备有限公司11.紫外可见分析装置上海博迅实业有限公司医疗设备厂12.RXZ智能型人工气候箱宁波江南仪器厂13.手掌型离心机（LX—100）宁波江南仪器厂14.XYJ—875净化工作台（GB6168—85）苏州市伟业空调净化有限公司15.微电脑智能化控制新型电热恒温鼓风干燥箱（DHG—9123A）宁波江南仪器厂16.各种规格Tips、Tubes和培养皿等。2.1.3试剂1.TaqDNA聚合酶(5units.μL-1)：购自上海生工生物工程技术服务有限公司；2.dNTPs其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP均为10mmol.L-1，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；3.10×PCRBuffer购自上海生工生物工程技术服务有限公司；4.LB液体培养基蛋白胨10g.L-1，酵母提取物5g.L-1，NaCl10g.L-1，PH7.0,高温高压灭菌后4℃保存；5.TCBS培养基平板TCBS按照说明书上参量调整PH7.0后加入相应的琼脂粉，高温高压灭菌后冷至60℃铺平板；6.酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）(体积比)4℃避光短期保存；7.氯仿/异戊醇（24:1）（体积比）4℃保存；8.NaAC5mol/l高温高压灭菌后4℃保存；9.10%SDS：SDS10%，pH7.2，室温保存；10.10×TEBuffer10mmol/LTris-HCl，1.00mmol/LEDTA，pH视需要而定，高温高压灭菌后4℃保存；11.50×TAEBuffer配制方法：称量Tris242g，Na2EDTA.2H2O37.2g于1L烧杯中；向烧杯中加入约800ml15 去离子水，充分搅拌均匀；加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；加去离子水定容至1L后，室温保存。其他倍数TAE按照对应倍数要求稀释即可。12.CTAB/NaCl溶液：10%CTAB，0.7MNaCl在80ml双蒸水中溶解4.1gNaCl，然后缓慢加入10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，同时加热并搅拌，可加热至65℃溶解，定容终体积至100ml；13.RnaseA溶液：将RnaseA溶于10mol/LTris-Hcl(pH7.5)，15mmol/LNacl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，冷却后用1.5mL离心管分装成小份保存于-20℃。2.2方法与步骤2.2.1实验材料准备及形态学观察配置TCBS培养基，高压灭菌后倒在平板内，将所取得到的水样按原液加入生理盐水而分为五个稀释梯度浓度接种至平板上，每个梯度做三个重复，用划线法接种在平板上，在培养箱中培养一段时间后，挑出单菌落后接种在新的TCBS培养基上继续培养。从而分离纯化得到的两株菌。两株菌在TCBS培养基和2216E平板培养基上30℃培养1天。分别对此两株菌在TCBS培养基及2216E平板培养基生长的菌落形态学特征进行观察记录。2.2.2改良弧菌DNA提取方法由于弧菌本身富含黏性多糖，蛋白等杂质尤其是多糖物质难以除去，应用传统法提取弧菌DNA效果不理想，经过多次尝试后用改良后的DNA提取方法DNA质量效果较好。现将改良弧菌DNA提取方法的展示步骤如下：1.从培养皿或斜面上挑取单菌落至大试管LB液体培养基，大试管液体扩繁12h左右，收集10ml培养液，10,000g离心2min离心；2.加入2mlTE悬浮沉淀菌体，再加入溶菌酶100ul（50mg/ml）、RnaseA10ul(10mg/ml)，摇匀后；37℃水浴30min；3.加入120ul10%SDS和蛋白酶K(20mg/ml)10ul，混匀后；60℃水浴30min—1h；注意观察粘稠度增加和破壁效果。4.加入500ul5mol/LNaCl，320ulCTAB/NaCl，65℃水浴10min；5.3ml酚氯仿(25:24:1)抽提一次（一定要混匀）；在4℃，12，000g离心10min；6.转移上清后用等体积氯仿异戊醇(24:1)抽提2-3次（转移上清过程中应避免吸入中间沉淀杂质，建议用剪掉尖端的Tips来吸取转移上清）；在4℃，12，000g离心10min；7.加入1/10体积的(3mol/L)NaAC，0.6体积异丙醇（或1体积的无水乙醇）沉淀DNA；在4，12，000g离心1min；8.用70%的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质。9.所得的沉淀DNA用50ul水溶解，加入50ul的5mol/l的NaCl溶液，充分混匀。加入0.6倍体积的异丙醇沉淀后重新70%酒精洗涤。风干后，用25ul水溶解样品。10.风干后，用50ul水溶解样品，-20℃保藏以备进一步使用。2.2.3DNA测定凝胶电泳：制备1％的琼脂糖凝胶，5μlDNA样品和1μl6Xloadingbuffer混匀后添加至加样孔，电泳100V，20min。电泳检测可鉴定DNA样品的完整性和质量，通过电泳中DNAmarker也可推算出DNA大致浓度。15 超微量紫外可见分光光度：取1μlDNA样品，以1μlddH2O为对照，超微量紫外可见分光光度计测定OD260/OD280和浓度。2.2.416SrRNA基因的扩增与测序PCR扩增两株未知优势弧菌的16SrRNA基因所用的引物为通用引物。上游引物：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’；下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT–3’。25μl的反应总体系中包括：模板DNA1μLPCRbuffer2μL上游引物1μL下游引物1μLdNTPs2μLTaqase0.5μLQQH2O17.5μL总体积25μL混匀后，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→34个扩增循环(94℃变性45sec→温度梯度退火→72℃延伸适当时间→72℃继续延伸10min。PCR产物经琼脂糖/1×TAE凝胶电泳和紫外检测后，回收目的DNA条带。PCR扩增产物经检测后送上海生物工程技术公司测序。2.2.5生物信息学分析对两株优势弧菌测序后的16SrRNA基因序列结果的生物信息学分析主要基于16SrRNA基因序列比对和系统发育树构建来对此两株优势弧菌的种属分类学地位进行鉴定。为确定测序所得的两株未知弧菌的16SrRNA基因序列和模式弧菌的16SrRNA序列之间的相似性或同源性，利用Clustal软件将序列按照特定规律排列，利用Clustal程序序列排列在一起后进行同源性分析。Clustal程序有许多版本，ClustalW（Thompson等，1994）[15]，根据对亲缘关系较近的序列间空位情况，确定如何在亲缘关系较远的序列之间插入空位。为进一步确定此两株未知弧菌的种属关系，我们根据基因测序结果和相关网站上的弧菌属内和弧菌属间的16SrRNA基因序列来进行系统发育进化树的构建。弧菌属间选择了杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)，弧菌属内种选择了多株哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）、多株溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）以及霍乱弧菌（Vibriocholerae）、拟态弧菌（Vibriomimicus）、创伤弧菌（Vibriovulnificus）等。对于此两株未知分离菌的16SrRNA基因序列通过NCBI的Blast检索系(http://www.ncbi.nlm.nih.gov／Blast／)或RDP网站（http://rdp.cme.msu.edu/）进行序列同源性分析，并使用MEGA4.0软件的AlignmentClustal/AlignbyclustalW在与GeneBank数据库或RDP数据库中获得的序列相似性较高的菌株的序列进行多序列匹配排列(MultipleAlignments)和成对序列匹配排列（PairwiseAlignments），采用MEGA4.0(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，MEGA)软件构建系统发育树，采用邻接法(neighborjoining15 method)建树方法，并通过Bootstrap法(1000次重复)检验。系统学分类描述不同生物之间的相关关系，通过系统学分类分析可帮助人们了解所有生物的进化历史过程[16]。构建系统树具体步骤如下：1.建立txt文档，从NCBI或RDP网站下载不同属种的16SrRNA基因fasta文件，将所需序列复制到记事本中。Wps建树时，先将属内所有种的序列下载，还有科内其他属各选择一个或多个序列下载下来，其中sp等的种不需要加入到记事本中来。2.将下载的序列和已经得到的两株未知菌的序列并入到同一个txt文档中，并在MEGA4.0上进行比对修饰构建系统发育进化树。①打开MEGA4.0软件②输入序列Alignment→AlignmentExplorer/Clustal→ok→yes→复制记事本上所有序列到MEGA4.0中→AlignmentClustal/AlignbyclustalW→ok③转换成MEGA格式：Data→ExportAlignment→导出MEGAFormat和FastaFormat（命名保存）④打开MEGAFormat序列框→phylogeny→BootstrapTestofphylogeny→Neighbor→Joining→compute⑤Image→saveasEnhancedMetafile→命名保存3结果与分析3.1两株弧菌的分离及形态学观察最初环境样品为朱家尖浅水区水样，用梯度浓度平板法在TCBS上培养，分离物间的菌落特征有一定差异。因此选择来自不同编号分别为XHS-2和461的两个菌株作进一步研究。XHS2-9号菌株和461号菌株这两株弧菌的个体形态特征较为相似：这两株菌革兰氏染色均为阴性,呈短杆状或短弧状,都可运动,两株弧菌的大小均为0.6µm-0.8µm×0.9µm-2µm。而菌落形态比较见表1。表1菌落形态比较table1thecomparisonofthecolonymorphology15 图1A图1B图1菌落形态图（TCBS培养基）Figure1thefigureofcolonialmorphology(TCBSculturemedium)图1A中为461号菌株，图1B为XHS2-9号菌株thefigure1Arepresentsthecolonialmorphologyof461strainVibrio，andthethefigure1BrepresentsthecolonialmorphologyofXHS2-9strainVibrio3.2两株弧菌的DNA提取及测定提取弧菌的总DNA经超微量紫外分光检测纯度（OD260/280值1.8左右）和浓度（1000ng/uL左右)均较好。利用改良法提取DNA电泳结果表明总DNA质量较佳（见图1中XHS-2和461），而传统法提取总DNA电泳结果表明总DNA仍由于富含粘性多糖未被除去而呈滞状（见图2中XHS-2和461）。XHS2-9(2)461(2)XHS2-9461M15 图2两株弧菌总DNA电泳图Figure2TheDNAgelelectrophoresisofthetwostrainsVibrioM表示为Marker，XHS2-9（2）表示为改良法提取XHS2-9弧菌DNA的电泳图，461（2）表示为改良法提取461弧菌DNA的电泳图，XHS2-9表示为传统法提取XHS2-9号弧菌DNA的电泳图，461表示为传统法提取461号弧菌DNA的电泳图。TheMrepresentstheMarker,XHS2-9(2)representstheDNAgelelectrophoresisbythemodefiedmethodoftheXHS2-9strainVibrio.461(2)representstheDNAgelelectrophoresisbythemodefiedmethodofthe461strainVibrio.XHS2-9representstheDNAgelelectrophoresisbythetraditionalmethodoftheXHS2-9strainVibrio.461representstheDNAgelelectrophoresisbythetraditionalmethodofthe461strainVibrio.3.316SrRNA基因序列的PCR扩增与测序本实验对两株弧菌的16SrRNA基因PCR扩增的引物为通用引物。上游引物：5’-AGAGTTTGATC(C／A)TGGCTCAG-3’；下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT–3’。PCR产物经凝胶电泳鉴定图如下，基因长度约1000bp左右，说明扩增目的基因成功。PCR扩增产物由上海生物工程技术公司进行基因序列测定。XHS2-9461M图3PCR结果电泳图Figure3ThegelelectrophoresisofthePCRproductM表示为Marker，XHS2-9表示为以改良法提取的XHS2-9号菌株总DNA为模板，以通用引物为引物扩增出的16SrRNA基因片段，而461表示为以改良法提取的461号菌株总DNA为模板，以通用引物为引物扩增出的16SrRNA基因片段。15 MrepresentstheMarker.XHS2-9representsthatthis16SrRNAgenefragmentisamplifiedwiththetemplateoftheXHS2-9strainVibriototalDNAbytheimprovedDNAextractionmethodandwiththeuniversalprimerastheprimer.while461representsthatthis16SrRNAgenefragmentisamplifiedwiththetemplateofthe461strainVibriototalDNAbytheimprovedDNAextractionmethodandwiththeuniversalprimerastheprimer.3.416SrRNA基因序列分析分离菌XHS2-9号菌所扩增的16SrRNA基因序列长度为1067bp，而461号菌所扩增的16SrRNA基因序列长度为1242bp。XHS2-9和461号菌株与S000426482Vibrioharveyi(T);NCIMB1280T;AY750575菌株以及>gi|AY373027.1|Vibrioalginolyticus16SribosomalRNAgene序列部分比对结果如下：图416SrRNA基因序列部分比较分析图Figure4thepartialcomparisonanalysisphotogramsofthe16SrRNAgene3.5系统发育分析16SrRNA基因序列分析鉴定一般能够精确到种的水平，因此可以用来鉴定用其他方法难于区分的弧菌。弧菌属间的代表选择了杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)模式菌（typestrain），弧菌属内种选择了多株哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）、多株溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）以及霍乱弧菌（Vibriocholerae15 ）、拟态弧菌（Vibriomimicus）、创伤弧菌（Vibriovulnificus）等参与进化树的构建。图5461及XHS2-9弧菌16SrRNA基因系统进化树Figure5thePhylogenetictreeofthe16SrRNAgeneincluding461andXHS2-9strainvibrios分支旁的数字为BootstrapTest1000次的置信度(%);标尺表示1%的核苷酸序列差异Numbersnearthebranchesarebootstrapprobabilityvalues(%)with1000replicates;Scalebarcorrespondsto1%differenceinnucleotidesequence由图5可以看出461号菌株与溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）在进化系统发育树上聚集为一个分支，而XHS2-9号菌株则与哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）聚集为一个分支。4讨论4.1形态学观察弧菌与人类肠道感染性疾病和水产品养殖感染性疾病有关，与人类生活密切相关。据相关研究表明，已知的致病弧菌有70多种，哈维氏弧菌(V．harvey)、副溶血弧菌(V．parahaemolyticus15 )、溶藻弧菌(V．alginolyticus)、鲨鱼弧菌(V．carchariae)、霍乱弧菌（V.cholerae）、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、鳗弧菌(V．anguillarum)和最小弧菌(V．mimicus)等是主要的致病弧菌。其中溶藻弧菌与哈维氏弧菌较难区分，因为溶藻弧菌与哈维氏弧菌都同属于哈维氏弧菌群，在系统分类学上，通过形态学观察以及生理生化检测都难以达到准确的鉴定结果。分离的两株弧菌菌落形态上有一定的相似性，光学显微镜下观察到的形态结构，可运动性，大小也很相似。菌落形态之间有一定差异，溶藻弧菌的菌落（TCBS培养基）直径一般稍大于哈维氏弧菌。菌落湿度，色泽，边缘规则性也有所不同。但是根据以上的结果，仅通过形态学观察只能给出初步的判断而不能做出最终鉴定结果的依据。本次实验并未涉及相关的生理生化鉴定反应，根据相关资料，弧菌属菌种具有兼性厌氧、氧化酶阳性、发酵葡萄糖产酸不产气、对弧菌抑制剂O/129(2,4-二氨基-6,7-二异丙基喋啶磷酸盐,150µg/mL)敏感等特征，溶藻弧菌和哈维氏弧菌的测定结果都一致。4.2改良弧菌DNA提取方法传统法提取的DNA对于弧菌来说，由于特性各异，有些较为适用，但是仍有大量弧菌由于富含黏性多糖、RNA等杂质而导致提取DNA效果不佳。通过试剂盒（MOBioUltracleansoilDNAisolationkit）提取的弧菌总DNA效果也较好，但是若提取弧菌DNA的种类繁多时，费用较多。而使用改良法提取DNA利用CTAB/NaCl和高盐条件下黏性多糖沉淀的特点而除去多糖，对提取后的DNA重新使用NaCl提高DNA溶液中盐浓度而重新洗涤而进一步除去黏性多糖，这样提取的DNA效果较为理想，也适合进一步的实验以及保藏备用。4.3弧菌分子鉴定结果16SrRNA基因的功能同源性高而且古老，其中既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，且其序列变化与进化距离相适应，因此16SrRNA基因是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”。通过分析16SrRNA基因序列，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系及亲缘关系的远近，如：DNA杂交同源性在60％一70％以上，或细菌间16SrRNA序列同源性达到97％以上的菌株就可定为一个种，如同源性只有95％，则判定为属于不同属[17]。应用16SrRNA基因可以快速鉴定表型上难以区分的弧菌。哈氏弧菌与创伤弧菌之间，以及双氮弧菌与鳗弧菌等通过表型难以区分，通过16SrRNA基因来对弧菌进行鉴定和区别已经有学者对此作出研究。但对于哈维氏菌群内通过16SrRNA基因来鉴定尚未有人做出鉴定，而且16SrRNA基因分析的高速度，高精度，高通量可以为大规模研究菌落生态演替和生长环境变化打下理论和工具基础。Blast分析结果表明XHS2-9号菌株的16SrRNA基因序列与包括模式菌株在内的几株哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）最为接近,相似性均为98%以上,而与所有其它弧菌相似性均不到93%。461菌株的16SrRNA基因序列与包括模式菌株在内的几株溶藻弧菌（Vibrioharveyi）最为接近,相似性均为98%以上,而与所有其它弧菌相似性均不到93%。461号菌株、XHS2-9号菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈氏弧菌模式菌株的16SrRNA基因序列比较如图4。16SrRNA基因系统发育树(图5)上461号菌株与溶藻弧菌紧密聚集为一个分支,而与其它弧菌明显区分。XHS2-9号菌株与哈维氏弧菌紧密聚集为一个分支，而与其他弧菌明显区分，综合上述形态、生理生化特征、16SrRNA基因序列分析结果,可将菌株461鉴定为溶藻弧菌，XHS2-9号菌株为哈维氏菌株。5结论1.本文建立了一种基于CTAB-NaCl法的改良的DNA提取的方法，主要通过对黏性多糖的沉淀而多步除去，从而从富含黏性多糖的弧菌中提取获得了高质量的DNA。2.本文以16SrRNA基因作为分子标记对环境样品中分离的两株未知弧菌样品进行系统发育学分析从而对其分类学地位进行鉴定，鉴定结果为461号菌株为溶藻弧菌，而XHS2-9号菌株为哈维氏弧菌。15 3.利用16SrRNA基因作为鉴定这两种较难区分的在海水特别是近岸养殖海水中较常见的优势弧菌，将会为水产品养殖、环境微生物学中群落更替以及校正过去系统分类学的错误提供一种重要的工具手段。虽然16SrRNA基因序列具体分子进化的系统发育机理目前还未能有明确的结论，但是本次实验作为弧菌系统分子分类学的一部分，一方面有助于进一步阐明弧菌的系统发育学分析，另一方面也为通过进一步研究与其他相关基因结合更进一步提高分子鉴定的分辨率从而为弧菌系统分类学提供了更多的实验支持，具有重要的理论意义和应用价值。参考文献[1]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京科学出版社.2001:106-128.[2]CristianeCThompson,AnaCarolinaPVicente,RangelCSouza.Genomictaxonomyofvibrios[J].BMCEvolutionaryBiology.2009,9(258):2131-2148.[3]Williams,Willkins,Baltimore.Bergey＇sManualofSystemaicBacteriology[M].1986:284-296.[4]ThompsonFL,KloseKE.VibriotheFirstInternationalConferenceontheBiologyofVibrios[J].Bacteriol2005,188(13):4592-4596.[5]DubnauD,SmithI,MorellP,etal.GeneconservationinBacillusspecies.Conservedgeneticandnucleicacidbasesequencehomologies[J].PmcNailAcadSciUSA.1965,54(2):491-498.[6]WoeseCR.Bacterialevolution[J].MicrobiolRev.l987,5(1):221-271.[7]WoeseCR,FoxGE.Phylogeneticstructureoftheprokaryoticdomain.Theprimarykingdoms[J].ProcNatlAcadSciUSA1977,74(11):5088-5090.[8]BioscaEG,OliverJD,AmaroC.PhenotypiccharacterizationofVibriovulnificusbiotype2,alippolysaccharide-basedhomogeneousOserigraphwithinVibriovulnificus[J].ApplEnviMicrobiol.1996,66(3):918-927.[9]YamamotoS,HarayamaS.PCRamplificationanddirectsequencingofgyrBgeneswithuniversalprimersandtheirapplicationtothedetectionandtaxonomicanalysisofPseudomonasputdastrains[J].ApplEnvironMicrobiol.1995,61(3):1104-1109.[10]杨鸢劫,俞菊华,陈辉等.暗纹东方鲢非O1群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测[J].水产学报.2006,30(4):525-530.[11]FouzB,AmaroC.IsolationofanewserovarofVibriovulnificuspathogenicforeelsculturedinfreshwaterfarms[J].Aquaculture.2003,21(7):677-682.[12]韩先朴,卢全章.鳗鲡弧菌病病原的分离与鉴定[J].微生物学报.1984,24(4):386-391.[13]林天龙,许斌福,董传甫等.鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定[J].中国人兽共患病杂志.2005,21(11):995-997.[14]王国良,金珊,薛良义等.海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究[J].黄渤海海洋.2000,18(3):85-89.[15]ThompsonC,ThompsonK,VandemeulebroeckeK,etal.UseofrecAasanalternativephylogeneticmarkerinthefamilyVibrionaceae[J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology.2004,54(5),919-924.[16]塞文婴,东秀珠.定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用[J].微生物学通报.2000,27(5):377-381.[17]朱传华,何建国,黄志坚.网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究[J].中山大学学报.2000,39(3):278-282.[18]谢珍玉,胡超群.弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展[J].热带海洋学报.2005,24(3):86-95.[19]郭明元,刘广锋,冯娟.1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析[J].中国水产科学.2006,13(5):823-828.[20]LinkousDA,OliverJD.PathogenisisofVibriovulnifwua(MiniReview)[J].FEMsMicrobiolLetters.1999,174(16):207-213.[21]邴旭文,阎斌伦,张晓君等.泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定[J].海洋与湖沼.2009,40(6):692-698.[22]张晓君,陈翠珍,阎斌伦等.凡纳滨对虾病原副溶血弧菌的表型及分子特征[J].海洋与湖沼.2009,40(5):654-662.15 附录：附录一XHS2-9号菌株的16SrRNA基因测序结果：>XHS2-9GGAGGTTGCGTAGCCTGATACGTGCAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGCGCCTTCGGGACTCTGAGACAGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGT附录二>461号菌株的16SrRNA基因测序结果15 AACGTTGGGGAGCCTACCATGCAGTCGAGCGGAACGAGTTATCATGAACCTTCGGGGGACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTGGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACGTTAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAGGTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTGTTTGCAGCGAGTAATGTCGGGAACTTCCAGGAGACTGCTGTGATAAACCGGAGAAGGTGGGGACGACGTCAGTCATCATGGCTACGAGTTAGCTACACACGTGCCTACATGGCGCCATTACAGGAGGGGCCAGCCAACCTTGGCCG15