毕业论文--灰霉菌转录因子Zn(2)-Cys(6)基因敲除载体的构建

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1、中文摘要灰霉菌是一种全球性植物致病真菌，在引起宿主植物的灰霉病。病原体可以侵染500多种植物，每年会造成巨大的经济损失。我们从具有超过50,000个T-DNA标记的转化子的灰霉菌突变体文库筛选致病性减弱的突变体，使用热不对称交错PCR（Tail-PCR）和序列分析方法，我们发现T-DNA标签插入到灰霉菌Zn（2）-Cys（6）转录因子的基因启动子区域，导致在病原体毒力的减弱。含有Zn(2)-Cys(6)锌指结构域的转录因子是灰霉菌中基因数量较多的转录因子家族。目前仅在真菌中发现了该转录因子，其对真菌生长发育的转录调控有积极作用。为了进一步阐明Zn（2

2、）-Cys（6）转录因子基因在灰霉菌生长发育过程中的调节作用，我们构建了灰霉菌Zn（2）-Cys（6）转录因子的敲除载体，并希望获得Zn（2）-Cys（6）转录因子基因的缺失突变体进行进一步研究。关键词：灰霉菌；Tail-PCR；转录因子；Zn(2)-Cys(6)；敲除载体IIAbstractBotrytiscinereaisaglobalplantpathogenicfungusthatcausesgraymoldonhostplants.Thepathogencaninfectmorethan500plantspeciesandcauseshug

3、eeconomiclosseseachyear.Apathogenicity-attenuatedmutantwasscreenedfromBotrytiscinereamutantlibrarythatcontainsover50,000T-DNAtaggedtransformants.UsingthemethodsofthermalasymmetricinterlacedPCR(Tail-PCR)andthesequenceanalyses,wefoundthattheT-DNAtaginsertedintothegenepromoterregi

4、onofB.cinereaZn(2)-Cys(6)transcriptionfactor,whichresultedintheattenuationofthepathogenvirulence.ThetranscriptionfactorcontainingtheZn(2)-Cys(6)zincfingerdomainisafamilyoftranscriptionfactorswithmanygenemembersintheBotrytiscinerea.Thetranscriptionfactors,currentlyonlyfoundinfun

5、gi,haveapositiveeffectonthetranscriptionalregulationoffungalgrowthanddevelopment.InordertofurtherelucidatetheregulationofZn(2)-Cys(6)transcriptionfactorgeneinthegrowthandpathogenesisofB.cinerea,wegeneratedtheknockoutvectorofB.cinereaZn(2)-Cys(6)transcriptionfactor,andhopedtoobt

6、ainagenedeletionmutantoftheZn(2)-Cys(6)transcriptionfactorforourfurtherstudy.Keywords:Botrytiscinerea;thermalasymmetricinterlacedPCR(Tail-PCR)；transcriptionfactor；Zn(2)-Cys(6)；knockoutvectorII目录前言1第一节灰葡萄孢菌与灰霉病1第二节Zn(2)-Cys(6)转录因子研究进展3第三节本研究的目的和意义4第一章实验相关材料与方法6第一节实验相关材料61.1供试菌株6

7、1.2供试载体61.3相关引物6第二节主要药品试剂与仪器62.1主要药品试剂62.2仪器7第三节培养基的配制73.1LB培养基73.2PDB培养基73.3MM培养基：73.4IM培养基：8第四节实验方法84.1配置反应体系84.2PCR反应程序94.3DNA凝胶回收94.4质粒的酶切94.5质粒连接104.6大肠杆菌DH5α感受态转化10第二章实验结果与分析10第一节灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的鉴定与分析101.1灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的鉴定与分析10第二节灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体的构建112.1灰

8、霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除载体构建策略112.2灰霉菌Zn(2)-Cys(6)转录因子的敲除