rhd基因不同转录子表达载体构建

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1、RHD基因不同转录子表达载体构建计：学位论文：46页表格：16个插图：13幅谢俊杰指导教师：邵超鹏教授申请学位级别：硕士学位论文提交日期：2012年4月学位授予单位：大连医科大学专业名称：临床检验诊断学论文答辩日期：2012年5月学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同

2、工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：亟!丝查!签字El期：旦年』月上Et关于学位论文使用授权的说明《眨”D名阁爷内i专象孑毛蜷铰绛千幻庭》系本人在大连医科大学攻读(博士、硕士)学位期间在导师指导下完成的学位论文。本人及指导教师完全了解大连医科大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅，同意学校将本论文加入：1．中国学术期刊(光盘版)电子杂志社——《中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数

3、据库》及CNKI相关数据库。2．中国科学技术信息研究所——《中国学位论文全文数据库》3．国家图书馆本人授权大连医科大学，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文，可以公布论文的全部或部分内容。论文作者签名：指导教师签名：签字目期：丝生皑月上日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)刖吾一⋯“””一”””“一一“”一“”一””一”一一一”．．”“”””一”5(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20(四)讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·．30(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31三、综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34(

5、二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯0O0t⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l四、附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45五、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46i?／-／O基因不同转录子表达载体构建硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：谢俊杰邵超鹏教授张印则教授苏宇清教授临床检验诊断学摘要目的：目前，Rh(D)抗原在红细胞膜的表达机制仍不清楚，研究发现其表达可能依赖于一个复合体。其中，RHD基因存在多种不同的另路剪接转录子，它们很可能参与了D抗原的表达。本实验分别构建RHD基因几种不同转录子的真核重

6、组表达载体，其中包括正常RHDcDNA，以及和正常RhDmRNA序列最相近的DEL9、DEL89转录子，期望为探讨Rh(D)抗原表达机制及复合体组成成分奠定相关基础。方法：收集Rh(D)ljfl性新生儿脐血，利用血清学及分子生物学方法分别鉴定其Rh表型和基因型：盐水试管法鉴定其Rh表型，包括RhD、C、c、E和e抗原；RHD基因型的鉴定则通过提取样本DNA，用检测部分D型的试剂盒对剧∞基因10个外显子进行检测，以确认其实属于包含所有10个外显子的Rh(D)阳性样本。利用全血总RNA提取试剂盒从此脐血网织红细胞中提取总RNA，根据

7、设计的不同引物，分别采用一步法和两步法进行RT．PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的基因片段，再切胶并溶胶纯化目的基因；将纯化后的基因片段连接至TOPOTA克隆测序载体pCR4．TOPO，通过转化至TOPl0大肠杆菌、以适量菌液均匀涂布至含氨苄青霉素的普通琼脂平板，37℃倒置过夜培养，其后，随机挑取单一菌落至含氨苄青霉素的液体培养基中37℃水平震摇过夜增菌筛选培养，随后以碱裂解法提取纯化质粒，再对提取的质粒进行测序，挑选出序列完整无突变的质粒：以该筛选质粒为模板，使用设计的新引物进行PCR，扩增为构建表达载体用的目的基因，经琼

8、脂糖凝胶电泳后切胶纯化，再将其连接至真核表达载体pcDNA3．1／V5．His．TOPO，通过再次转化至大肠杆菌、筛选增菌培养，提取并纯化质粒，最后经质粒测序筛选出含有序列正确、无突变目的基因，且插入方向正确的重组质粒。结果：血清学盐水试管法初步检测结果显示2份