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1、NT3基因逆转录病毒表达载体的构建作者：董智勇,李忱,陈东孟晓婷,陈雷,路来金【摘要】目的:分离大鼠神经营养素3（NT3）基因,构建pLEGFPNT3逆转录病毒表达载体。方法:利用RTPCR技术钓取大鼠NT3基因,克隆到测序载体pMD18T中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pLEGFPC1中,通过Lipofectamine2000导入包装细胞PA317。结果:RTPCR产物为776bp,经测序鉴定虽与GenBank中NT3基因的序列相差1个碱基,但不影响NT3蛋白质的表达;构建的pLEGFPNT3重组载体经酶切鉴定,证实NT3基因片段正确插入pLEGFPC1载体中。
2、转染包装细胞后,激光共聚焦显微镜下观察导入NT3基因的PA317细胞发绿色荧光。结论:分离得到了大鼠NT3基因成功构建了pLEGFPNT3表达载体。【关键词】神经营养素3;逆转录病毒载体;重组神经干细胞（neuralstemcells,NSC）的应用为脊髓损伤（spinalcordinjury,SCI）的治疗带来新的希望,而NSC移植治疗SCI的效果直接与移植细胞在损伤局部的存活、功能性分化以及再生轴突能否与靶器官重建突触联系密切相关,这三者主要是由损伤局部的微环境所决定的［1］。如何改善损伤微环境使其更有利于NSC的存活分化以修复SCI,神经营养因子（neurotrophins,11N
3、TF）起着至关重要的作用。神经营养素3（neurotrophin3,NT3）是在脊髓中作用最强的NTF,它可以明显促进皮质脊髓束的再生和NSC的迁移与轴突生长［2］;NT3能特异地提高出生后大鼠发育中皮质脊髓束侧枝发芽,支配它的靶组织［3］。SCI后NT3mRNA与蛋白质的表达与损伤前相比均有所提高,说明受损脊髓对NT3内源性需求增加［4］。通过转基因技术,可使含有NTF基因的神经干细胞（neuralstemcells,NSC）不断分泌所需营养因子,促使神经再生和功能恢复。本实验目的是利用RTPCR技术分离获得大鼠NT3基因,并通过携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的逆转录病毒
4、载体构建NT3基因的表达载体,为进一步将NT3基因导入NSC内,探讨应用转NT3神经干细胞治疗脊髓损伤的研究提供参考。1材料和方法1.1材料dNTP、DNAmaker、PCR产物回收试剂盒购自鼎国生物试剂公司;TagplusDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自Promega公司;HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶、pMD18T载体购自TaKaRa公司;Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;G418购自Gibco公司;Polybrene购自Sigma公司;pLEGFPC1购自BD公司;PCR引物由联星公司合成;PA317细胞购自第四军医大学实验动物中心。1.2方
5、法111.2.1NT3基因的调取、扩增、测序根据GenBank中大鼠NT3的基因序列(GenBank登录号为M34643),设计2条引物,并加入2个酶切位点HindIII（AAGCTT）、BamHI(GGATCC)和保护碱基:5′CGCGAAGCTTGCATGTCCATCTTGTTTTATGTG3′;5′GCCGGGATCCTCATGTTCTTCCGATTTTTCTTG3′;扩增产物大小为776bp。从出生2～3d的大鼠脑纹状体中提取组织总RNA,应用RTPCR法扩增NT3基因片段,回收DNA与pMD18T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,氨苄平板筛选后扩增重组质粒
6、pMD18TNT3,并进行小量提取,测序。1.2.2表达NT3的逆转录病毒载体的构建提取质粒pGEMTNT3和pLEGFPC1,分别用HindIII与BamHI进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳回收NT3与pLEGFPC1片段,将NT3用T4DNA连接酶与pLEGFPC1载体进行连接,连接子转化大肠杆菌JM109感受态细胞,转化细菌涂布LB氨苄平板筛选阳性重组质粒,挑取单菌落接种于2mLLB培养液中,37℃震荡培养过夜,小提质粒,用HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定出重组质粒,然后大量制备重组质粒pLEGFPC1NT3,-20℃备用。1.2.3逆转录病毒载体的包装和筛选pLEGF
7、PC1逆转录病毒载体中保留了病毒的包装信号以及介导病毒整合、11具有启动子和加工功能的2个LTR。将其导入病毒包装细胞系PA317进行包装可以产生具有感染能力的复制缺陷型重组病毒颗粒。按照Lipofectamine2000转染试剂盒提供的方法转染操作。转染前1d以3×108/L将PA317细胞接种于6孔培养板,以无抗生素的生长培养液培养。转染前汇合达90%~95%。次日以无血清培养液洗2次。溶解
