人胰岛素样生长因子Ⅰ和Ⅱ基因的克隆与表达

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1、人胰岛素样生长因子I和II基因的克隆与表达摘要胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactors,IGFs)是体内重要的生长因子，其由两种相关多肚组成:IGF-I和IGF-II。大量研究表明，它们对组织细胞的增殖、分化、凋亡，机体的生长发育及肿瘤的发生发展起重要的调节作用。为了获得大量纯度高的、具有生物学活性的人IGFs以满足基础研究与临床应用的需要，本文将hlGFs基因与pET系列原核表达载体进行了重组，在大肠杆菌BL21中初步进行了表达方面的实验研究。I，以人胎盘组织为实验材料，采用RT-PCR方法，获得了包含CDS的hIGF-I和hIGF-II基因片段，分别连入克

2、隆载体pMD18-T中，测序结果分析表明扩增的片段均为目的基因。2各另外设计一对特异性PCR引物，导入适当限制性内切酶切点，以上述连有目的基因的克隆载体为模板，采用PCR方法扩增基因片段，获得长度约230bp的IGF-I和219bp的IGF-II成熟肤基因序列。3.将hIGF-I与hIGF-II成熟肤基因进行双酶切后，分别连入原核表达载体pET-32a(+)和pET-30a(+)中，构建原核表达重组质粒pET-32a(+)-IGF-I和pET-30岭卜IGF-II。测序验证表达载体构建正确后，以BL21CDE3)作为宿主菌，进行融合表达研究。4.SDS-PAGE分析表明，重组质粒pET-

3、32a(+)-IGF-I在IPTG诱导下表达分子量约30kDa的融合蛋白，但其表达量不高，约为菌体总蛋白的10%左右;重组质粒pET-30a(+)-IGF-II在IPTG诱导下表达分子量约14kDa的重组蛋白，融合蛋白表达量约占菌体蛋白总量的35%05菌体采用溶菌酶裂解，融合蛋白以包涵体形式存在;对hIGF-I融合蛋白进行了westernblot分析，确认所表达蛋白为目的蛋白。关键词:人胰岛素样生长因子I;人胰岛素样生长因子I;基因克隆;基因表达CloningandExpressingofInsulin-likeGrowthFactorIandIIAbstractInsulin-like

4、growthfactors(IGFs)areconsistedoftwokinds叮peptide,oneisinsulin-likegrowthfactorI(IGF-I)andanotherisinsulin-likegrowthfactorll(IGF-II).ManystudiesshowedthatIGFsplayveryimportantregulatedrolesinthecellproliferationandapoptosis,pathogenesisofhumancancerandtissuedifferentiation.Inorderto洲sufficientqu

5、antitiesofpurebiological珍activehIGFstomeettheneedofbasicresearchandclinicaluse,weclonedthegeneofIGFsintopETplasmids,aseriesofprokaryoticexpressionvector,andexpressedtherecombinantplasmidsintheE.coliofBL211.GenesofIGFs,whichincludeCDS,wereclonedbywayofRT-PCRfromthetissueofhumanplacenta,thenligated

6、thegenesofIGFstothevectorofpMD18一thesequencesofIGFsarecorrectbysequencing.2.GenescodingmaturepeptideofIGFswereachievedbyPCRusinganotherpairofoligo-nucleotideprimerstoinducetothesuitablerestrictionenzymesite,andtheIGF-IproductofPCRcontains230basepairs,IGF-11contains2份basepairs.3.ThegenesofhIGF·工an

7、dhlGF-IIwereligatedintotheexpressionvectorpET-32a(+)andpET-30a(+)respectivelyaftercutbytherestrictionenzymes.weintroducedtherecombinantvectorpET-32a(+)-IGF-IandpET-30a(+)-IGF-I1intotheE.cotiofBL21(DE3)afterencodingfrag