胰岛素样生长因子-1基因表达及临床试验分析

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1、南京医科大学博士学位论文胰岛素样生长因子一1基因表达及临床试验研究中文摘要第一部分利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子一1(hIGF一1)的研究目的利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中研制有生物学活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子一1(rhIGF一1)。f方法将15kd人IG卜1(hIGF一1)前体cDNA基因插心家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体pBakPAK8中，经与野生型病毒DNA共转染家蚕细胞后，通过体内同源重组的方式获得重组病毒BmNPV／IGF—l。以BmNPV／IGF—l感染5龄家蚕幼虫，分别在感染后24，48，72，96

2、，1O8，l20h提取家蚕血淋巴液，以ELISA法测定不同时相家蚕血中IG卜1浓度，采用western山lot分析鉴定IGF一1免疫学活性，MTT法观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。结果ELISA测定显示，BmNPV／IGF_1感染家蚕幼虫后，72h起蚕血中IGF一1浓度随感染时间延长而逐渐增高(19．09“g／m1～23．36ug／m1)，12OhIGF一1含量达到最高值(23．36pg／m1)，westernlb1ot分析发现表达产物在蚕体内被加工成7．5kd成熟hIGF-1，并对NIH3T3细胞具有良好促增殖效应，其促细胞增殖能力明显优于来源于B．c

3、oli的IGF一1标准品。结论利用家蚕杆状病毒载体实现具有生物学活性和免疫学活性rhIGF一1的高效表达。177关键词人胰岛素样生长因子一1基因表达重组家蚕核型多角体病毒生物学活性免疫学活性南京医科丈学博士学位论文第二部分家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子一1(hlGF一1)纯化的研究目的利用亲扣层析的方法，’将家蚕幼虫中高效表达的rhIGF一1纯化并鉴定，以得到具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF—l纯化产物。f方法蚕血中的rhIGF一1初步提纯去除杂质后，采用亲和层析法，使rhIGF一1纯化。以ELIsA法测定纯化产物中rhIGF～1含量，采用sDS

4、—PAGE和western山lot分析鉴定rhIGF一1纯度及免疫学活性，MTT法观察其对MCF．7细胞增殖的影响。结果纯化后rhIGF一1浓度为3ug／ml，纯度为4O％左右，western-blot分析发现主要纯化产物为7．5kd成熟hIGF一1，所含非目的产物与hIGF一1无免疫交叉反应。细胞活性刺激实验显示，rhIGF一1纯品对MCF一7细胞有较好的刺激活性，促增殖能力优于来源于E．coli的IGF一1标准品。结论蚕血中rhIGF—l经亲和层析后初步得到纯化，并显示良好的免疫学活性和生物学活性。，j关键词重组人胰岛素样生长因子一1家蚕幼虫亲和层析纯化

5、产物活性第三部分利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子一2(hIGF一2)的研究目的研制有生物活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子一2(rhIGF一2)。f方法将14kdhIGF一2前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移栽体pBakPA】【8中，经与野生型病毒DNA共转染家蚕细胞，南京医科大学博士学位论文通过体内同源重组的方式获得重组病毒BmNPV／IGF一2。以BmNPv／IGF一2感染5龄家蚕幼虫，分别在感染后24，；48，72，96，108，120h提取家蚕血淋巴液，以ELISA法测定不同时相家蚕血中IGF一2浓度

6、，采用western—blot分析鉴定IGF一2免疫学活性，MTT法观察，其对NIH3T3细胞增殖的影响。结果ELlSA测定显示，BmNPv／IGF一2感染家蚕幼虫96h后IGF一2表达率最高，●每毫升血淋巴中约含IGF_2l4ug，western_blot分析发现表达产物在蚕体内被加工戍7。Okd成熟hIGF一2，并，对NIH3T3细胞具有良好促增殖效应，其促细胞生长能力明显优于来源于E．coli的IGF一2标准品。结论本研，究实现具有免疫学活性及生物学活性的rhIGF一2在家蚕杆状病毒表达系统的高效表达。关键词人胰岛素样生长因子一2家蚕核型多角体病毒基因

7、表达免疫学活性生物学活性第四部分胰岛素样生长因子一1基因治疗对糖尿病大鼠血糖调节的研究目的本研究采用基因治疗的方法，将胰岛素样生长因子一1(IGF—1)基因导入糖尿病(DM)大鼠体内，使IGF一1在DM模型整体水平得到高效表达，探讨其对DM大鼠血糖的调节作用。／方法以PCR方法扩增人成熟IGF—l基因片段，经BamH1和EcoRl酶切后与pcMV质粒构建重组转运质粒pcMV／IGF一1。链脲佐菌素诱导sD大鼠糖尿病模型，成模后治疗组大鼠(n=7)肌内注射pcMV／IGF一1Df{A4OOpg／鼠，对照组(C组，n=7)给予同等剂量pcMV空载质粒DNA，同时

8、设立正常对照组(N南京医科大学博士学位论文组，n=7