转过表达和低表达胰岛素样生长因子ⅰ基因牛成纤维细胞系制备

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1、杨美玲转过表达和低表达胰岛素样生长因子I基因牛成纤维细胞系的制备摘要胰岛素样生长因子I(Insulin．1ikeGrowthFactor-I，IGF．I)在哺乳动物胚胎发育中起着非常重要的作用。研究表明适当浓度的IGF．I能够提高体外培养的卵母细胞的成熟率，并通过抗凋亡作用提高体外胚胎的存活率，增加囊胚内细胞数目。但其作用机理还知之甚少。转基因动物和基因干扰技术作为研究基因功能的重要手段，可以用来探究基因在牛胚胎发育过程中的作用机理。为了阐明IGF．I在体外牛胚胎发育过程中的功能，本研究利用转基因技术，用脂质体和电击法将过表达载体pIRES2．EGFP．IGF1和干扰载体pGCsi．IGF1导

2、入牛胎儿成纤维细胞中，筛选得到稳定表达细胞株，为建立过表达IGF．I和低表达IGF．I的胚胎提供核供体，为进一步通过构建转基因胚胎模型来探究IGF．I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。1．过表达载体plRES2．EGFP．IGFl和干扰载体pGCsi．IGFl的构建(1)通过RT-PCR方法从牛肝脏总RNA中扩增胰岛素样生长因子I(IGF．I．)编码区eDNA序列，以T载体pMDl9．T为克隆骨架构建中间克隆载体pMDl9-T-IGFl。将IGF—I片段连接在双顺反子载体plRES2-EGFP的BgllI+SalI位点，构建过表达载体plRES2．EGFP．IGFl。限制性内切酶分析以及

3、对测序结果表明，本研究所构建的的过表达载体plRES2．EGFP．IGFl结构与序列均与预期设计相符合。(2)针对牛IGF．I基因的第594．622bp区域5’．GGCTCAGAAGGAAGTACAT-3’设计了一条发夹式RNA干扰片段，连接在干扰载体pGCsilencer-RFP上，构建了干扰载体pGCsi．IGF1。2．牛胎儿成纤维细胞的分离与体外培养内蒙古大学坝士学位论文通过组织块贴附法成功分离出牛胎儿成纤维细胞，利用DMEM+10％FBS培养液在37。C、5％C02、饱和湿度条件下体外培养和传代，各代成纤维细胞在DMEM+20％FBs+1O％DMSO培养液中冷冻保存；同时详细记录牛胎儿

4、成纤维细胞的形态和生长特性，绘制了第5和10代牛胎儿成纤维细胞的生长曲线，并制作和分析了第5代细胞中期染色体的数目。通过以上分析证明，分离和培养的牛胎儿成纤维细胞在体外培养环境下，随代次增加，生长速度渐缓；第五代染色体数目正常(2n=60)，可以用第五代前的细胞进行转染实验。同时检测了牛胎儿成纤维细胞对筛选药物G418和潮霉素的耐受性，浓度稀释梯度实验结果确定G418的最佳筛选浓度为800pg／ml，潮霉素最佳筛选浓度为50p,g／ml。3．牛胎儿成纤维细胞的外源基因转染以及转基因克隆细胞的筛选和鉴定用脂质体法和电击法转染牛胎儿成纤维细胞，48小时后分析转染效果并进行筛选。利用实时定量PCR技

5、术检测了转染48小时后载体的表达效率，与对照组细胞相比发现，转染过表达载体plRES2．EGFP．IGFl的细胞中IGF—I表达量显著升高，约是对照组的40倍(P

6、增，证实外源基因已稳定整合在转基因细胞基因组中，可以用做核移植的核供体细胞，制备转基因胚胎模型，为进一步研究IGF．I在体外牛胚胎发育过程中的机理奠定了基础。关键词：胰岛素样生长因子I，过表达载体，干扰载体，牛胎儿成纤维细胞，转基因杨美玲转过表达和低表达胰岛素样生长因子l基因牛成纤维细胞系的制备PRODUCTIONOFBOVINEFIBROBLASTCELLSFORINSULIN—LIKEGROWTHFACTOR．IOVEI冱XPRESSEDANDKNOCKED—DOWNABSTRACTItisreportedthatInsulin-likeG1．o砌Factor-I(IGF—I)playsa

7、keyroleinmammalianembryonicdevelopment．AppropriateconcentrationofIGF-Iraisesoocytesmaturationrate加vitro．Duetotheanti—apoptosiseffects，IGF—Iadvancesembryosurvivalandincreasestheinnermass’snumberofblast