节律基因mPeriod2抑制肿瘤细胞生长的体内外研究

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1、四Jfl丈学博士论文节律基因mPeriod2抑制肿瘤细胞生长的体内外研究生物医学工程专业研究生：华慧指导教师：王正荣教授肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，发病率居lO种重大疾病的第二位。虽然肿瘤的诊治取得了很多进展，但对肿瘤患者的长期疗效仍然亟待提高。动物实验和对人体肿瘤的研究均表明生物节律参与肿瘤的发生、发展。本项目立足于研究近日节律核心基因mPeriod2(mPer2)和肿瘤的关系。探讨节律基因mPer2在肿瘤细胞内过表达或低表达对肿瘤细胞生长和凋亡的影响，并深入研究其机制，进而寻求治疗肿瘤的新方向。尸B力作为近日节律钟控系统的

2、一个必不可少的组成部分，不仅调节近日节律．同时还影响器官功能。我们首先研究了Per2在肿瘤细胞中高表达是否影响癌细胞生长或凋亡．本研究采用脂质体介导法，将roPer2真核表达质粒pcDNA3．1(+)-mPer2和空质粒pcDNA3．1(+)转染Xd,鼠Lewis肺癌细胞株(Lewislungcarcinomacell，LLC)、小鼠乳腺癌细胞株(mousemammarycarcinomacell，EMT6)和NIH3T3细胞，采用MTT法、光镜下细胞计数绘制细胞生长曲线、细胞平板集落形成实验等方法研究mPer2过表达对小鼠肿瘤细胞

3、LLC和EMT6细胞增殖的作用。利用流式细胞术、基因组DNA片断分析、Hoeehst33342染色和电子显微镜观察细胞形态等方法研究mPer2过表达对小鼠肿瘤细胞LLC、EMT6细胞和NIH3T3细胞凋亡的作用。本研究证实过表达roPer2能明显抑制小鼠Lewis肺癌细胞株和小鼠乳腺癌细胞株的生长增殖，并能明显诱导以上肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞却无诱导凋亡作用。细胞周期检测发现roPer2过表达引起小鼠肿瘤细胞LLC、EMT6细胞Gl期阻滞。roPer2过表达后，肿瘤细胞的细胞核DNA降解。呈现典型的DNALadder区带特征，Ho

4、echst33342染色发现凋亡细胞明显增多。电子显微镜观察到mPer2过表达导致肿瘤细胞形态发生变化，细胞核染色质凝集，呈明显碎块状致密浓染。四川大学博士论文此外，为了解下调内源性mPer2基因表达对肿瘤细胞凋亡的影响，我们首先用lOOnMTPA处理LLC细胞以诱导内源性mPer2基因表达，其中一组仅用TPA处理，一组同时用TPA和随机反义寡核苷酸，另一组用TPA和mPer2反义寡核苷酸处理。处理后24小时，将细胞在血清饥饿条件下继续培养48小时，然后收集细胞，固定，行流式细胞分析，检测以上三组细胞凋亡情况。另用RT-PCR检测m

5、Per2基因表达情况．与仅用TPA处理组和TPA联合随机反义寡核苷酸处理组相比，mPer2反义寡核苷酸处理抑制了TPA诱导的mPer2基因表达。流式细胞分折表明抑制内源性mPer2基因表达可显著降低血清饥饿所诱导的细胞凋亡．这些结果从另一个侧面证实了mPer2基因促进细胞凋亡．为了进一步探讨节律基因mPer2过表达抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的机制，本研究采用RT-PCR、蛋白印迹和流式细胞术等方法研究mPer2过表达对小鼠Lewis肺癌细胞株(LLC)凋亡相关基因如p53，c-Myc、Bcl-2，BcI-XL和Bax等基因m

6、RNA和蛋白表达的影响。RT-PCR结果显示mPer2过表达对LLC细胞c-Myc，Bcl-2和Bcl-XL基因的mRNA表达具明显的抑制作用，同时可增强p53和Bax基因的mRNA表达．蛋白印迹和流式细胞术检测都显示mPer2过表达可明显降低LLC细胞c-Myc、Bcl-2和BcI．)(L的蛋白表达水平，同时明显增强p53和Bax的蛋白表达水平．这些结果表明PER2的促凋亡作用是因为其增强了促凋亡的信号传导和削弱了抑制凋亡的基因。除了以上体外试验外，我们也观察了PER2对Lewis肺癌在小鼠体内生长的影响．采用小鼠Lewis肺癌细

7、胞株(UC)于C57BL／6小鼠右前肢腋窝皮下接种，建立C57BL／6小鼠移植瘤模型。小鼠以12小时光照，12小时黑暗交替(LDl2／12)提供光源照制2周。随机分组，雌雄各半．采用pcDNA3．1(+)与体内转染试剂混合物、pcDNA3．1(+)．mPer2与体内转染试剂混合物在移植瘤内多点注射．10天后收集标本，采用流式细胞术检测各组移植瘤细胞的周期及凋亡率，免疫组化法分析PCNA蛋白表达．结果显示。pcDNA3．1(+)．mPer2组瘤重明显低于pcDNA3．1(+)对照组，抑瘤率为51．7％．免疫组化结果提示pcDNA3．1

8、(+)．mPer2组PCNA表达明显低于对照组，差异有统计学意义(P