靶向pcna基因sirna和shrna抑制膀胱癌生长体内外实验的研究

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1、靶向PCNA基因的siRNA和shRNA抑制膀胱癌生长的体内外实验研究靶向PCNA基因的siRNA和shRNA抑制膀胱癌生长的体内外实验研究中文摘要中又捅斐膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，手术治疗后仍有较高的复发率。现阶段，如何有效地治疗膀胱癌并预防复发依然是基础和临床研究的重点和难点问题。RNA干扰现象被认识已有10年左右时间，但到目前为止，未发现哺乳动物有内源表达的小干扰RNA(siI悄A)。一些研究者采用体外化学合成的方法获得siRNA来进行肿瘤治疗的研究，siRNA在细胞内作用时间较为短暂，适用于研究瞬时效应，不宜用来长期观察RNA干扰后细胞生物学功能的变化。能够表达短发夹结构

2、RNA(删A)的真核表达质粒可以克服siRNA作用时间短暂的缺点，研究者通过脂质体等辅助转染方法将质粒转入肿瘤细胞内，质粒在细胞内长时间表达shRNA，短发夹结构RNA在细胞浆内被Dicer酶切割加工成siRNA后发挥RNA干扰作用。近年来，RNA干扰技术为研究膀胱癌提供了一个全新的途径。恶性增殖是癌细胞的主要特征之一，长期以来，增殖细胞核抗原(PCNA)仅仅是用来判定包括膀胱癌在内的许多肿瘤恶性增殖程度和不良预后的标志物，很少有研究者将PCNA直接与恶性肿瘤的治疗联系在一起，将PCNA基因作为小干扰RNA治疗膀胱癌的靶基因国内外文献未见有报道。本课题设计思路：首先，体外化学合成siRN

3、A，通过脂质体包裹后转染膀胱癌细胞，研究siRNA瞬时mRNA干扰效果以及对膀胱癌细胞生物学行为的影响，再根据siRNA的序列构建shR．NA真核表达质粒载体，进一步研究shRNA表达质粒持久mRNA干扰效果以及对膀胱癌生长的影响，旨在通过检测靶向PCNA基因的siRNA(PCNA．siI瑚A)和shRNA(PCNA．shRNA)在体内外抑制膀胱癌生长的效果为治疗膀胱癌并预防复发作出一些积极有益的探索。本研究分四个部分。第一部分：靶向PCNA基因的有效siRNA序列的筛选目的：设计并筛选出靶向PCNA基因的有效siRNA序列，为后续研究提供依据。方法：针对人类PCNA基因mRNA(NM．

4、002592)序列设计并化学合成三条siRNA。靶向PCNA基因的siRNA和shRNA抑制膀胱癌生长的体内外实验研究中文摘要选择100nM作为siRNA的最佳终浓度，在siRNA转染后24、48、72和96d'时用荧光定量RT-PCR(RTq．PCR)检测T24细胞PCNA．mRNA表达水平的变化；在siRNA转染后72d,时用western．blotting检测T24细胞PCNA蛋白表达水平的变化。结果：3条PCNA．siRNA在转染后48d,时干扰效果最好，rnRNA抑制率均在80％以上，其中PCNA．siRNA3抑制效果最好，mRNA抑制率高达90．2±1．7％。PCNA蛋白表达

5、和mRNA表达水平的变化趋势一致。结论：PCNA．siRNAl(靶位点291．309)、PCNA．siRNA2(靶位点550．568)和PCNA．siRNA3(靶位点679．697)均为有效序列。PCNA．siRNA3干扰效果最好。关键词：T24细胞PCNAmRNAsiRNA筛选第二部分：靶向PCNA基因的siRNA抑制膀胱癌生长的体外实验研究目的：探讨PCNA基因表达瞬时抑制后"1"24细胞生物学行为的变化。方法：选择干扰效果最好的PCNA．siRNA3来抑制膀胱癌T24细胞PCNA基因的表达，在PCNA基因表达抑制后用MTT检测T24细胞生长抑制率，DAPI染色检测T24细胞凋亡，F

6、CM检测T24细胞周期和凋亡，Transwell体外侵袭实验检测T24细胞体外侵袭能力。结果：在转染后第l、2、3、4、5天T24细胞生长抑制率，干扰组分别为23．7±2．8％、70．8±0．7％、69．8±0．4％、48．8±0．3％、31．7±0．2％，阴性对照组分别为2．4±0．9％、3．9±0．1％、5．8±0．6％、12．2±0．4％、8．1±0．1％，干扰组T24细胞生长抑制率明显高于阴性对照组，以第2、3天效果最佳(p值均<0．05)；在转染后第3天，干扰组多数视野可见少量的凋亡细胞，而空白对照组、阴性对照组视野内几乎看不到凋亡细胞，流式细胞仪检测干扰组细胞凋亡率为7．4±

7、0．6％，较空白对照组和阴性对照组明显增)JnCp值均<0．05)，干扰组有更多的细胞被阻滞在S期和G1期(p值均<0．05)：在转染后第3天，Transwell体外侵袭实验显示：空白对照组、阴性对照组、干扰组穿过滤膜的细胞数分别为95±7、90±8和为20+2。干扰组穿过滤膜的细胞数较空白对照组和阴性对照组少(p