靶向2apro基因的sirna抑制ev71复制的研究

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1、分类号：UDC：R373．2578密级：公珏多高号：!Q2窆窆S!!!垒Q25@江。藩大擎硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目塑囱2△：：：基国的苎iR堂地生I』星yZ!复生』』的盟宜2014年6月分类号：UDC：R373．2578密级：公珏编号：lQ29壁SUl4025江艨大擎硕士学位论文靶向2Apm基因的siRNA抑制EV71复制的研究siRNAtargetedtothe2AprogeneforinhibitionofEnterovirus71replication作者姓名：刘海冰指导教师：陈建国小组成员i王胜军申

2、请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2014年4月论文答辩日期：2014年6月学位授予单位：江苏大学学位授予日期：2014年6月答辩委员会主席：许化溪独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：刘珥彬妙I’y年多月／罗曰Ⅳl1b“l

3、’学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科

4、学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密口。学位论文作者签名：麦1御)奶如孵61月7了日指导教师虢f、矽(豺b／午年(

5、月伊江苏大学硕士学位论文摘要目的：以肠道病毒71(EV71)的2A蛋白酶基因(2APro)为靶序列化学合成小干扰RNA(siRNA)，转染人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)，用感染复数为O．01的EV71感染，通过检测RD细胞形态学改变、细胞活力、病毒蛋白和病毒核酸来验证siRNA．2APm抑制EV71的能力，从而为采用RNA干扰(IⅢAi)技术治疗EV71感染提供一个新的潜在的靶点。方怯：(1)以EV71的2AprO基因(Ⅲ001860．1)为靶序列化学合成siRNA，并且通过BLAST检测siRNA序列对靶基因的特异性以及与人类基因的同源

6、性。(2)用Lipofectamine2000阳离子脂质体作为转染试剂将不同浓度FITC标记的BLOCK-汀FluorescentOligo转染RD细胞，通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率。(3)将siRNA转染RD细胞，24h后用EV71感染，观察RD细胞的形态学改变，用MTT法检测各处理组细胞活力，通过westernblot和荧光定量PCR检测病毒蛋白和病毒核酸。(4)siRNA转染RD细胞后，ELISA检测各处理组IFNQ和IFNB的水平。结果：(1)以EV71的2Apro基因为靶序列化学合成了三个siRNA，分别命

7、名为siRNA．69、294和319(siRNA一2Aoro)，经BLAST比对，显示对靶基因具有高度的特异性，与人类基因无明显同源性。靶向2APro基因的siRNA抑制EV71复制的研究(2)通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率，发现用2“l的Lipofectamine2000脂质体，转染浓度为60nM的BLOCK-iTFluorescentOligo时，转染效率达到最高，可达87％以上。(3)从RD细胞形态学观察结果可以看出，siRNA．2Apro处理组的细胞仅发生了轻微的病变，而siRNA．SCS阴性对照组、模拟转染组

8、和仅病毒处理组则出现了一系列较严重的形态学改变。MTT实验、westernblot和荧光定量PCR检测结果表明三个siRNA都具有抑制病毒的能力，但效果具有差异，其抑制病毒能力的强弱依次为siRNA．69>siRNA．294>siRNA．319。(4)ELISA检测结果显示各处理组IFNQ和IFN13水平基本一致，没有明显统计学意义，提示EV71受抑制是由于siRNA介导的RNA干扰作用产生的，而非I型干扰素的抗病毒作用所致。结论：以EV71的2Apr。基因为靶序列化学合成的siRNA能有效地抑制EV71的增殖，因此，2Apro基因可以作为R

9、NAi技术治疗EV71感染的一个潜在治疗靶点。关键词：EV71，RNA干扰，siRNA，2Apro基因，病毒抑制，手足口病江苏大学硕士学位论文ABSTRACTObj