HLAG反义基因转导的抑制肿瘤细胞免疫逃逸的实验研究

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1、山东省医学科学院硕士学位论文HLA-G反义基因转导的抑制肿瘤细胞免疫逃逸的实验研究姓名：温见燕申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：张玲20030501山东省医科院研究生毕业论文HLA．G反义基因转导的抑制肿瘸细胞免疫泌逸的实验研究研究生：温见燕导师：张玲研究员专业：免疫学中文摘要目的肿瘤细胞的免疫逃逸和肿瘤的发展可归因免疫系统对肿瘤细胞反应的无能。肿瘤逃避免疫效应细胞有几种机制，如MHC．I类分子表达减少、下调甚至缺失，表达Fas配体，释放免疫抑制性细胞因子，缺少共刺激因子等。HLA—G是近几年开始研究的免疫抑制分子，生理条件下主要存在

2、胎盘，维持母胎耐受。由于HLA．G在一些肿瘤细胞异位表达并对浸润在肿瘤局部的NK和T细胞具有强烈的抑制作用，形成了一条肿瘤免疫逃逸的新途径。为了切断HLA-G免疫抑制作用，增强免疫效应细胞的功能，本研究设计合成了HLA—G反义寡核苷酸(antisensedeoxyoligonucleotide，ASODN)和无关寡核营酸(nonsensedeoxyoligonucleotide，NODN)，并进行了硫代化修饰，以脂质体包裹，形成反义寡核苷酸．脂质体复合物(ASODN／NODN．LF)，转导入人绒毛膜细胞癌细胞系JEG．3中，从基因一蛋白一细

3、胞效应多层次水平，观察反义基因下调HLA．GmRNA和蛋白的表达，提高NK、cD3AK等免疫效应细胞识别杀伤功能，揭示反义HLA．G基因逆转肿瘤细胞免疫逃逸的抗肿瘤作用和机制，对反义HLA—G基因的肿瘤生物治疗应用和丰富肿瘤治疗的方法提供理论和实验依据。．1一山东省医科院研究生毕业论文方法设计合成HLA．GASODN／NODN，并进行硫代化修饰。Lipofactamine7M2000介导法形成ASODN，NODN．LF复合物。采用RT—PCR方法检测HLA．GmRNA表达水平的变化：流式细胞术检测细胞表面HLA．G蛋白表达水平的变化：检测A

4、s0DN处理后，对JEG一3诱导外周血单个核细胞(peripheralb100dmononuclearcellPBMc)凋亡的影响；MTT法检测：①可溶型HLA—G分子对NK杀伤的抑制作用：②ASODN作用于JEG一3细胞后，该细胞对CD3AK杀伤敏感性的变化；⑧AsODN处理JEG一3细胞，进行肿瘤一淋巴细胞混合反应中对cD3AK增殖的影响；④As0DN作用后，JEG．3作为第三釉抑制细胞对同种异体混合淋巴细胞反应的影响：ELIsA方法探讨As0DN调节CD3AK细胞因子IFN．Y的变化。结果1．HLA-GASODN作用后对JEG-3细胞

5、HLA—G表达的影响1．1HLA—GASODN4．Opg／m16．O“g／m1．8．0p∥ml可显著抑制JEG·3细胞HLA．G蛋白的表达(P<0．01)。1．2HLA—GASODN6．0ug／ml作用于JEG-3细胞后抑制膜结合型mRNA的表达水平，相对表达值从1．24下降为O．81。HLA．G2，G4的mRNA相对表达量从0．20降为O．11。2．ASODN作用后逆转JEG。3可溶型HLA．G对NK杀伤活性的抑制作用用JEG一3细胞的24、48、72h上清处理NK细胞，NK细胞的杀伤活性在效靶比为50：1，25：l，12．5：1时，未处

6、理组分别为19．29％7．6％6．7％，23．13％18．97％1294％，25．41％14．52％6．34％，均显著低于培养液对照组的72．96％53．19％37．28％，75．7l％67．82％56．2l％，74．78％6l，93％55．15％，用ASODN处理后，NK细胞的杀伤活性恢复为58．12％44．38％23．51％．70．78％61．94％515％，68，97％57．36％50．12％。．2一＼山东省医科院研究生毕业论文3．ASODN处理JEG．3细胞后对CD3AK细胞杀伤敏感性的变化AsODN处理组在效靶比为25．O：l，1

7、2．5：1，6．25：1的CD3AK细胞的杀伤率分别为74．92％，43．97％，30．56％，明显高于对照组的41．92％，21．86％，13．51％和NODN组的47．646％，28．05％，20．79％(P

8、反应体系中IFN．Y产生的影响ASODN处理组JEG一3-cD3AK共培养上清中IFN-Y含量为498．757pg／ml显著高于CD3AK单独培养组和未用MMC灭活未处理组的14