基因工程第四章目的基因的分离和合成

《基因工程第四章目的基因的分离和合成》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第四章目的基因的分离与合成通常我们把插入到载体内的那个特定的片段基因称为“外源基因”将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为“目的基因”。获得目的基因进行分子克隆，一方面为了获得表达产物，另一方面就是要获得大量拷贝，以便进行基因结构和功能的研究7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新第四章目的基因的分离与合成获得目的基因的方法：限制酶直接分离从基因组文库中筛选逆转录制备cDNA或从cDNA文库中筛选人工合成PCR扩增基因改造7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新第四章目的基因的分离与合成第一节限制酶直接分离一、用于一些物理图谱已确定的、背景资

2、料比较清晰的原核生物基因的制备对已定序列的DNA分子只需用已知识别序列的限制酶进行一次或几次的切割，分离纯化所需的DNA片断，与适当的载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。对已知定位的目的基因只要根据目的基因两侧的已知酶切位点，用适当的酶切割，一次即可获得目的基因。7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新第一节限制酶直接分离二、用于一些物理图谱未确定的、背景资料不明的原核生物基因的制备采用鸟枪法（shotgun）：从细菌细胞中分离细菌染色体用机械切割或限制酶分解得到各种大小的基因片段用相同的限制酶酶切载体质粒，与染色体片断连接输入到受体细胞转化子的选择7/10/2021

3、苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基

4、因产物功能检测法（筛选模型的建立）7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法操作的改进例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连

5、接前将DNA片段进行分级分离2.0kb1.6kb1.8kb7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新基因文库的基本概念基因库（genepool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（genelibraryorgenebank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）第二节建立

6、基因组文库7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库第二节建立基因组文库7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N

7、=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因文库至少需要180万个克隆第二节建立基因组文库7/10/2021苏州科技学院生物系叶亚新基因文库的基本概念基因文库的质量标准除了尽可能高的完备性外，一个理想的基因文库应具备下列条件